southpig的世界

生物芯片入门（二）：制作和结果分析
芯片的构建和阅读
Vivian G. Cheung, Michael Morley, Francisco Aguilar,
Aldo Massimi, Raju Kucherlapati & Geoffrey Childs
联合基因科技有限公司 吴凌凌 译

　　摘要

　　制作芯片和获得芯片的数据有许多不同的方法。这里我们介绍了在学术领域中两种芯片的构建和使用。除了详细说明了技术细节外，我们还对组成和方法的优缺点进行了评论，同时还介绍了杂交的方法。用我们所建立和使用芯片的方法来回答生物领域问题的事实证明了这种技术在大学的环境下是可行的。

　　一种获得基因功能信息的高通量的方法是cDNA芯片。在一块显微镜载玻片上包含了几百至几千个固定的DNA样本，以类似于Northern blot 和 Southern blot的方法进行杂交。了解了这个方法后，我们决定在我们各自的实验室Pennsylvania大学（Penn）和Albert Einstein学院医学部（AECOM）制作了高速，高精度的芯片。这个设备是由Stanford医学院Pat Brown制造的，第一次论证了这个方法的可行性。我们的目标是（1）最终以合理的价格，用一块或几块芯片来检测哺乳动物细胞中每个基因的表达，（2）发展以芯片为基础的绘图方法，（3）兼顾硬件和超作方法，尽可能地提高灵敏度。

　　玻片的优势

　　一个理想化的支持物允许探针有效地固定在其表面，探针与目标分子能牢固地杂交结合。与另一种用于制作芯片的标准支持物尼龙一样，玻璃有许多的优点。它也有其特长。首先，DNA样品以共价键的形式结合在处理过的玻片上。第二，玻璃是一种耐用的材料，能够耐高温和高离子强度溶液的洗涤。第三，玻璃不是多孔材料，使杂交的容量能保持在最小，因此能提高探针与目标分子的退火效率。第四，由于材料的低荧光性，不会有背景的影响。最后，两种不同的探针能够标上两种不同的荧光标记，在一片芯片上同一个反应中同时孵育；尼龙就受到连续或平行杂交的限制。

　　芯片需要大量的探针固定（或排列）在玻片上，这里我们描述了AECOM芯片，扫描仪以及进行了关于设计和操作的讨论。如果想得到关于Penn芯片的信息，请到http://w95vcl.neuro.chop.edu/vcheung查找。

　　自动化装置性质

　　AECOM点样仪，Albert，产生高密度的分隔的矩阵，矩阵包括cDNA、基因组DNA或其他类似的生物物质。机械的基本组成有计算机控制的三轴向的机械手和独特笔尖装置。

　　设计特点

　　机械手被设计成能自动从96或384孔的微量滴定板中选取样本，12支点样笔同时升起，每个点样笔收集了250-500nl溶液，在每块玻片上放置0.25-1nl，产生的点的大小范围直径为100-150μm。机械手是由设置好的程序控制的，能进行连续的点样，每一点避免与相邻的点接触，每点的中心距离大约为200-250μm。检测的精密度大约是10μm。机械手放置在可视工作平台上（Newport公司），允许放置大量的显微镜玻片，微量滴定板，三个洗涤装置和一个干燥装置。

　　洗涤装置是个固定的容器，装有蒸馏水，两次微量滴定板使用后需要更换。当笔尖浸过液体后，机械手要来回摇动点样笔（大约5Hz）来增加清洁程度。虽然我们认为没必要，但电脑控制的洗涤液可用超声波或流动的水来替代。干燥装置实际上是干/湿真空吸尘器（Sear公司，美国），接头与插入笔尖的限制插口相匹配。干燥器要做到在笔尖有快速流动的空气围绕，保持局部真空。

　　所设计的机械手的重要目的是要达到在最小的震动范围内的高速和高精确性。我们使用了保湿的可视工作平台，精密螺旋驱动地机械滑动，高分辨率的解码器的随动系统和沿着x轴方向的两侧支杆，避免了在一些系统中所见的悬臂结构。利用第二x轴的滑面来增加系统的固定性，能依次产生更快的定位以及通过工作平台的准确一致性。这些特点允许在精确率下的快速运动，使机械手能在一秒内对两块显微镜载玻片操作。

　　带有笔尖的点样笔支持物装置是一个重要的部分。我们的设计结合了线形运动，控制点样笔的方向，允许在最小的阻力下精确地纵轴运动，以防止在其他方向上的错位。我们设计的另一个独特之处是可调整的末端丝，允许在10μm的范围内校直每个点样笔的轴，以保证所有12支笔尖能在同一时间内接触显微镜玻片。而另一个没有这特点的设计需要与点样笔的精确长度一致以适应多点样笔的操作。每个点样笔由低强度的弹簧作为支持，保证在未接触表面时能回到伸展的位置。笔尖是由直径大约为1.6mm的不锈钢材料逐渐处理变细直至每点直径为100μm。再沿着中心垂直切割，在尖端分成两部分，每部部分5μm。

　　这个系统由可视基础程序控制的，在Microsoft Windous NT环境下运行，软件提供：印刷程序具体化；完成系统校正；显示真正地时间位置、速度和产生的错误；与其他功能参数一样重要的随动系统；动态地显示打印过程中的重要参数。随动系统控制的计算机中的插件能够动态地控制高速、复杂的机械手的动力，并设计成以它的运动来控制程序的语言。可视原理和随动插件运动控制程序相互作用，交换了参数、图象和所需的命令。微量滴定板的同一性是由扫描它的阅读器所决定的。由于有笔尖易被灰尘和纤维阻碍的问题，打印机现在被附上了软保护壁允许三个方向的随意进入并且合并了高效率效式空气过滤与吹风机以达到湿气的再流通。

操作

　　打印的第一步是将显微镜载载玻片以统一的形式排列在工作平台上，用在激光平台上的1孔作为引导，然后按下。膜微量滴定板固定器突然定位在平台的某一位置，用同样的孔来排列自己。同样的微量滴定板固定器保持在冲洗状态，也能被放置在任何方便的位置。使用者可任意选择保留的配置或进入配置中的参数。缓慢移动模式用于校验，使坐标位置正确。最后，使用者提示增加微量滴定板，机械手进入自动点样操作。点样笔从微量滴定板中收集样品并点样，从而对每块载玻片进行同样的操作。然后冲洗/干燥操作，再对新的样品进行重复操直到当所有的样品全部完成。在点样的过程中，程序自动地将同一来源的微量滴定板保留在磁盘上，优化每一点以及载玻片上的X-Y终点位置。这个文件稍后与基因说明文件合并，产生载玻片上已印好的点的复合说明。

　　观察

　　点大小的精确性依赖着笔尖的规格。尖端精细的槽口要求特殊的微加工工具就象Wire EDM。我们用的笔尖是TeleChem的，与我们的笔轴相匹配。它们的性能是可接受的，虽然它们是十分脆的。我们希望能获得有进展，更耐用的样式。

　　扫描仪特点

　　我们设计和制造的激光扫描仪IRIS，是Standford大学和国家健康研究所研制的器械的衍生产品，使灵敏度和动态范围最大化。我们也试图将运转的适应程度结合到设计中，因此在将来能够进行改进，允许更有效的荧光染料的测定（最近引进了DNA自动测序仪）。两个有染料标记的目标杂交后，玻片被扫描后产生16位TIF图象。每点的象素强度是与染料分子的数量以及与PCR产物斑点杂交探针数量成比例。

　　设计特点

　　激光扫描仪有一些关键的组成。软件是与HPVEE绘图程序语言同步的程序。规划图形的运动，控制A/D转换数据的捕获，处理两个频道的信号，显示每一次扫描的真实的时间参数，产生TIF文件的标题以及保存TIF图象的结果。八个样本引进的数据平均为每一个象素，转换为二进制整数，为校正图象的变化，轮流进行的扫描，然后保存。使用者可以看见大屏幕的示波境波形就是每次扫描的平均值，最小值和最大值统计。

　　操作

　　自动化分级操作搜索扫描模式，在X轴的方向上连续地通过显微镜载玻片，然后在Y轴的方向上移动一个象素的位置，产生一个bi-方向的光栅模式。X轴的信号解码器是由特殊设计的触发回路处理的，取消了每次扫描后的随动震动，产生了在所有方向上的A/D转换的清晰触发。回路保证了微米以下的空间分辨率和图象的线性结构。两条激光光柱合成联合直线，通过双重光束分割滤波器反射过目标，形成刺激显微镜载玻片上染料分子发荧光的精细聚焦光束。部分荧光是由目标分子捕获的，通过双光分裂滤波器发送，在滤波立方中分成红绿两种信号，在波段通过器中过滤。发送入各自的转换电信号的光电管（PMT0）中。每个光电管被A/D转换器放大，过滤和采样。转换器完成8个附加抽样，软件达到平均每象素8个样本，产生真实的16位分辨率的图象。

　　观察

　　我们最初获得了不恰当的信噪比，因此制定了双成分过滤器，（根据浓度）建立了我们规格，降低DC成分的干扰水平。立体过滤成分的去除，进一步改进了灵敏度。我们原先的设计有包括两个相配的聚焦镜的立体过滤器，小孔和不同的元件，这些如果组合在一起形成了共焦显微镜。但是我们发现光学共焦不能加强检测。事实上，镜头使干扰水平增加了两倍，这是由于自动的荧光性-整个装备导致了所需信号相当大的衰减，结果所有信噪比大大地减弱。我们因此推断在X轴方向的立体过滤在应用中没有起到作用。我们发现激光输出的清晰过滤对降低干扰是基本的。最后，为了达到可视成分的精细排列和精确的最佳聚焦，利用了刻度载玻片和软件，获得了高灵敏度的双物镜系统和广大的动态视野范围。

　　有时遇到的问题是镜子干扰的存在，由十分明亮但比我们所需的点的图象要小（<1μm-25μm）的信号组成。我们认为这是由于灰尘和没结合的染料所形成的。在干净的环境中操作，严格遵守杂交程序对减少这些影响是十分必要的。

　　在屏幕上显示的波形是可重复的。当比较同一行的重复扫描，我们发现极好的重复性。从中我们降低了由于扫描仪的光学和电子学因素而没传入的有用信号所产生的变形。当调节不同的控制参数时，这个显示能力也使我们精确地测量了在信号-干扰率上的影响。PMT冷却是包括在保持电子干扰最小化的设计中的。迄今为止，当PMT冷却到-18℃时，我们还没有找到在提高灵敏度方面的巨大进展。系统的干扰水平还没有达到电子干扰的水平，它的重要元件仍旧有光学干扰。可能是杂交进程中在载玻片上留下了一些自动显示荧光的残余。我们正开发新的方法来进一步减少干扰水平。

　　从目前系统的灵敏性来看，10 mW激光的能量看来是足够的，5mW就能产生令人满意的结果，并且显示了在这个区域中系统的增进是直线的。PMT的电压和激光能量是可交换的，不需要降低信号-干扰率。

　　性能

　　比较扫描仪的性能，通常没有可接受的标准。为了测定我们扫描仪的性能，通过利用一些包含不同浓度Cye3染料校准的载玻片来测定灵敏性。结果显示扫描仪能可靠地测定在100μm点上少于10-18 摩尔的染料的浓度。我们试图实现对染料结合和杂交能力测定的附加实验，但是性能显示我们用目前的探针预备方法能探测到低量的mRNA。初步的结果显示我们的扫描仪有比市场上的扫描仪高四倍的灵敏度，同时能处理多三倍的信号（在饱和状态前）。我们的扫描仪有超过1000倍的动态范围，明显比高密度过滤器的10倍的动态范围要好。我们能同时进行双色成像，但是是有限制的，因为有两个通道之间的干扰。这能通过在一个时间扫描一种颜色的方法而最小化，虽然当每块载玻片用两种以上的染料时，交叉激发仍能产生干扰现象。由我们的系统产生的典型的芯片，扫描用典型的12.8μm的象素大小，能产生16位分辨率的2048 by 1550象素的图象。每个点覆盖了大约100个象素，成像的扫描时间大约是40分钟。

　　杂交注意事项

　　DNA的数量。芯片上每点DNA的数量是可估计的。猜想每点堆积的形状是半球形的，它的容量是可以计算的：

一点的量=1/2 × (4/3πr3 )

每点的DNA的数量=样本的浓度 × 每点的量

　　斑点的容量少意味着用于杂交的探针的数量也很少，即使样本的浓度很高。必须努力减少这样的限制。一些因素必须考虑到，除了探针DNA的数量外，还有与目标分子相互补的探针DNA的比例，长短，目标分子的活性，就象用于检测信号方法的灵敏度影响着信号的强度。

　　杂交信号的浓度是与目标分子活性成比例的，与它的长度成反比，因此目标分子的特殊活性是十分重要的。每次实验的杂交时间也应该精确测量。

　　沉积机制

　　点样笔的精确切口允许利用毛细现象从微量滴定板中吸取样本。压力由点样笔向下的运动产生，载玻片的表面张力拖动样本从切口内到玻片上。点的大小依赖于点样笔向下及离开载玻片的加速度和载玻片表面的张力。点样笔向玻片的加速度与点的大小成比例，因此能调整到所希望的点的大小。当点样笔从玻片收回后，在切口内的样品和沉积在载玻片上的样本之间的流量就形成了。如果收回的速度很快尖端的量就被打断了，产生了大的点，不是完美的半球形。如果收回的速度十分慢，点样量就在尖端"修剪"了，留下的点就小。

　　DNA样本

　　样本准备在96孔的板上，乙醇沉淀并用70%的乙醇洗涤,然后在2×柠檬酸钠（SSC）中重建。样本浓度的重建依赖于所需点的大小和样本的粘稠度。如果样本需要排列为小的点，它们的浓度就要高。但是，限制因素是笔尖的设计，会使样本粘稠而难以排列，那些浓度大于2μg/μl的太粘了而不能点样。我们点样的目标浓度是每个样本15ng一个点。虽然我们在2SSC中重新建立了样本，但是溶液的离子浓度能在1×SSC到5×SSC之间而不影响杂交，然而样本溶解在溶液中后离子浓度高于5×SSC就很难与载玻片接触。

　　将DNA固定到玻璃片

　　在DNA排列到玻片上以后，它们是自然干燥的。样本的固定是通过紫外线（UV）固定的，形成在DNA上的胸腺嘧啶脱氧核苷残基和硅烷玻片上氨基之间的共价键。类似的方法也用于将DNA样本固定在尼龙膜上。为了完成最大化的杂交，要在紫外线交联之前，芯片要保持微量的湿润，通过将"排列"暴露在沸水中，然后在254nm的紫外线下暴露到0.27J/cm2 。我们发现精密测量照射的量是十分有利的，只要确定产生最佳信号的照射最佳水平。过长时间的照射导致了由于连接不充分而产生的DNA损失和个别地，DNA样本的过多的断裂。在交联后，过多的DNA分子在室温下被0.1%的SDS冲洗掉，然后在杂交以前，排列的样本在95℃的水中变性。

　　杂交中的

　　有许多方法使目标分子和探针进行杂交。我们发现三个工作溶液对于荧光探针和固定在玻璃上的DNA的杂交是很好的；与溶剂和温度不相关。一般来说，在42℃，甲酰胺基础上的杂交比65℃水溶液中的要好，因为促进了信号和杂质的比率。但在甲酰胺中的动态杂交要比在水溶液中的慢，当用低拷贝量的目标分子时，建议使用有右旋糖苷硫酸盐或聚乙烯乙二醇的水溶液。

　　类似的方法用于使"杂质"最小化：用Denhardt试剂，十二烷基硫酸钠（SDS）修剪鲑精DNA，tRNA和Cot1DNA。当我们用cDNA时，也包括多聚A RNA或与富含T的序列相连接的多聚A。

　　讨论

　　我们集体的努力显示了在学术环境下如何实现芯片技术的。在AECOM，芯片和扫描仪是由家庭工程师制造的，使用家庭工程师的好处是她/他是亲手改良和维修仪器的。在Pennsylvania大学，芯片是在大学机械店的帮助下在实验室中制造的；扫描仪（General扫描仪公司）是购买的。

　　芯片构建的改良技术必须与基因组克隆图谱实用性的增加，好的cDNA克隆，分析工具的良好使用相匹配。这些工具的综合和易操作性对基因研究发展的速度是十分重要的。

生物芯片的制作

　　对于一些实验室来说，如果现成的商品化芯片不能满足研究需要，而自行设计向厂家定做芯片也不能满足时间的需要时，就需要自制芯片。要成功的制作芯片，需要准备3大材料：准备固定在芯片上的生物分子样品、芯片片基和的制作芯片的仪器。研究目的不同，期望制作的芯片类型不同，制备芯片方法也不尽相同，以DNA芯片为例，基本上可分为两大类：一类是原位合成（即在支持物表面原位合成寡核苷酸探针），适用于寡核苷酸；一类是预合成后直接点样多用于大片段DNA，有时也用于寡核苷酸，甚至mRNA。

　　原位合成有两种途径，一是原位光刻合成（Affymerix公司专利技术，参见前文介绍），该方法的主要优点是可以用很少的步骤合成极其大量的探针阵列。某一含N个核苷酸的寡聚核苷酸，通过4×N个化学步骤能合成出4N个可能结构。例如合成想要8核苷酸探针，通过32个化学步骤，8个小时可合成65，536个探针。而如果用传统方法合成然后点样，那么工作量的巨大将是不可思议的。同时，用该方法合成的探针阵列密度可高达到106/cm2。

　　另一种原位合成是压电打印法(Piezoelectric printing)。原理与普通的彩色喷墨打印机相似，所用技术也是常规的固相合成方法。不过芯片喷印头和墨盒有多个，墨盒中装的是四种碱基合成试剂。喷印头可在整个芯片上移动。支持物经过包被后，根据芯片上不同位点探针的序列需要将特定的碱基喷印在芯片上特定位置。冲洗、去保护、偶联等则同于一般的固相合成技术。该技术采用的化学原理与传统的DNA固相合成一致，因此不需要特殊制定备的化学试剂。每步产率可达到99%以上，可以合成出长度为40到50个碱基的探针。

　　尽管如此，原位合成方法仍然比较复杂，除了在基因芯片研究方面享有盛誉的Affymetrix等公司使用该技术合成探针外，其它中小型公司大多使用合成点样法。

　　点样法是将预先通过液相化学合成好的探针、或PCR技术扩增cDNA或基因组DNA经纯化、定量分析后，通过由阵列复制器（arraying and replicating device ARD）或阵列点样机（arrayer）及电脑控制的机器人，准确、快速地将不同探针样品定量点样于带正电荷的尼龙膜或硅片等相应位置上（支持物应事先进行特定处理，例如包被以带正电荷的多聚赖酸或氨基硅烷），再由紫外线交联固定后即得到DNA微阵列或芯片。点样的方式分两种，其一为接触式点样，即点样针直接与固相支持物表面接触，将DNA样品留在固相支持物上；其二为非接触式点样，即喷点，它是以压电原理将DNA样品通过毛细管直接喷至固相支持物表面。打印法的优点是探针密度高，通常1平方厘米可打印2,500个探针；缺点是定量准确性及重现性不好，打印针易堵塞且使用寿命有限。喷印法的优点是定量准确，重现性好，使用寿命长；缺点是喷印的斑点大，因此探针密度低，通常只有1平方厘米400点。点样机器人有一套计算机控制三维移动装置、多个打印/喷印头、一个减震底座，上面可放内盛探针的多孔板和多个芯片。根据需要还可以有温度和湿度控制装置、针洗涤装置。打印/喷印针将探针从多孔板取出直接打印或喷印于芯片上。检验点样仪是否优秀的指标包括点样精度、点样速度、一次点样的芯片容量、样点的均一性、样品是否有交叉污染及设备操作的灵活性、简便性等等。

　　一、点样设备

　Telechem公司全新SpotBot Personal Microarrayer
对于那些需要经常小批量使用多种不同的研究用芯片的普通用户来说，向Affymetrix这样的大公司定做自行设计芯片的时间和成本太高，然而又不太可能支付得起一套高性能的大型生物芯片点样制作系统，Telechem公司最新推出的SpotBot个人微阵列点样机绝对是一个好消息。这种只有一台台式普通离心机大小(30cm x 30cm x 22cm)的个人芯片点样机功能相当完备：
　4针的打印头(4-Pin Printhead)可以配各种Stealth点样针；
　一次可以放置14张玻片(25mm x76mm/片)；每张片可以点3600个点(9mm x9mm区域)；
　最大的打印范围可达20mm x 70mm；将来软件升级后每张片将可以打50400个点；
　点样可以选择每个样品单点、双点或者3点；
　可以放置1块384孔板，可以手工换板；
　完成一块384孔板的点样时间为2小时(每个样品3点，14张玻片)，6小时可在14张玻片上点超过1000个样品(双点/样品)；
　先进的自动清洗干燥台保证样品之间没有交叉污染；
　透明罩保证点样工作环境的清洁和恒定的温度和湿度；
　开关门感应器保证用户的安全；
　轴运动偏差±10μm；
　外形轻巧可爱，连真空泵和蠕动泵在内总重仅6.4公斤，
　最令人惊喜的是价格相当便宜！



　　美国Cartesian Technology公司的MicroSys 5100小型台式芯片工作站MicroSys 5100也是专门为实验室做小量芯片研究工作设计的一套台式工作站。一次处理10张芯片，采用接触式点样技术，使用标准的CHipMaker或Stealth点样针，可放置1块96/384孔样品板，并配有一套载片真空固定系统和一套针头清洗真空干燥系统。价格低廉，非常适合经费紧缺的研究部门做芯片应用的中小型研究项目使用。

　　对于中型到大型的用户则可以选择美国Cartesian Technology公司PA系列、SQ系列生物芯片点样制作系统。这家公司在芯片技术刚出现时就致力于开发能将生物芯片变为现实的点样制作系统，并得到生物芯片技术的开创者M.Schena的支持。通过与著名的点样针制作厂家TeleChem公司联合，融合自身拥有多项专利的喷点技术，生产的芯片点样系统一直在该领域独占鳌头。

　　PA系列是应用专利的 PinArrayTM （针阵列）技术，在玻片等基质上生产高密度芯片的生物芯片点样系统，该系列的产品均使用TeleChem公司的 ChipMaker 和 Stealth 系列点样针。点阵密度可以达到2500/cm2

　　PixSys 5500 PA Workstation.

　　适用于中等工作量研究用途的点样工作站。该系列配备精密的Telechem点样针，也可同时选配synQUAD微定量喷头，点样快速、精确，适用范围广泛，使目前生物芯片点样系统的主流产品。



　　ProSys 5510 PA Workstation.

　　应用其专利的PinArrayTM 技术在玻璃片基上生产高密度芯片的高通量点样工作站。适用范围广，点样快速精确，自动化程度高，一次可处理100张芯片，适合大规模的工业化生产使用。
SQ系列生物芯片点样系统

　　SQ系列使应用其专利的synQUADTM 技术在各种类型的膜及玻片等基质上进行非接触的同步喷点系统，还可以用来进行转板等微定量液体转移工作。点样速度可达1000点/分钟。

　　二、芯片片基

　　用点样法制作芯片，除了专用的仪器外，还需要要选择合适的固相支持物--芯片片基，也就是载体材料。一般来说各种芯片片基都选择经过相应处理的硅片、玻璃片、瓷片或聚丙烯膜、硝酸纤维素膜、尼龙膜等作为支持物。作原位合成的支持物在聚合反应前要先使其表面衍生出羟基或氨基（视所要固定的分子为核酸或寡肽而定）并与保护基建立共价连接；作点样用的支持物为使其表面带上正电荷以吸附带负电荷的探针分子，通常需包被以氨基硅烷或多聚赖氨酸等。我们在下面介绍一些常见的相关产品：

　　膜：与玻片相比，膜的优点是与核酸亲和力强，杂交技术成熟，通常无需另外包被。由于尼龙膜与核酸的结合能力、韧性、强度都比较理想，以膜为基质的芯片绝大多数采用尼龙膜。Schleicher & Schuell 公司是专业生产杂交/过滤膜的公司，著名的硝酸纤维素膜即是该公司首家推出的。S&S的Nytran SuPer Charge正电荷尼龙膜带电量是常规正电荷尼龙膜的3倍，与核酸的结合力更强，而且又大大降低了背景和非特异结合，克服背景高的缺点，加上韧性强，反复杂交10次依然保持表面平整的优点，成为制作尼龙膜芯片的最佳选择。Nytran SuPerCharge有多种规格，详细资料可以向基因有限公司查询。

　　玻片：用于制作芯片的玻片必须特别清洁和平滑。玻片表面必须包被合适的功能基团能将靶DNA片段固定住并防止其在杂交洗涤过程中被冲洗掉。经表面化学处理的玻片是一种持久的载体，它可耐受高温和高离子强度；玻片具有不浸润性，使杂交体积降低到最小，因此提高了退火时的动力学参数，疏水表面可以使点密度大于亲水表面（因为亲水表面上样品点将扩散）；玻片的荧光信号本底低，不会造成很强的背景干扰；玻璃芯片可使用双荧光甚至多荧光杂交系统，可在一个反应中同时对两个以上的样本进行平行处理。由上可知，以玻璃为载体的芯片更具有发展和应用的前景。

　　S&S公司的CAST Slides(Cat.No.10484181,20/box)将SuPerCharge正电荷尼龙膜附着在玻片上，这种特殊的玻片综合了尼龙膜的高亲和力和玻片刚性的优点，是世界上第一个膜结合玻片。而FAST Slides (Cat.No.10484182,20/box)则是在玻片表面包被一种专利的聚合物，这种聚合物能迅速与DNA以非共价但是不可逆的方式结合。由于表面包被层的多孔性和厚度使单位面积的DNA结合能力比常规化学表面处理玻片要高得多，使得检测更加灵敏。其杂交方式和传统的杂交一样。适用的检测方法包括同位素检测、化学发光法和荧光检测--由于包被的多聚物有效降低对入射光的散射，FAST Slide同样适合用激光共聚焦成像系统进行荧光检测。

　　TeleChem ArrayIt Super Microarray Substrates(25mm x 76mm)采用高清洁度，超平表面的的玻片并进行化学修饰，各项技术指标居同类产品前列。SuperClean(Cat.No.SMC-25, etc.)， SuperAmine (Cat.No.SMM-25,etc.)和SuperAldehyd(Cat.No.SMA-25, etc.)三种规格可偶联核酸、蛋白、甚至细胞，且偶联过程可以在室温及中性条件下进行。

　　Clontech提供的DNA-Ready Type I Slides (Cat.No.7880-1, 5 slides/box)是氨基修饰的，能结合200bp-10kb的修饰和未经修饰的DNA，DNA-Ready Type II Slides (Cat.No.7881-1, 5 slides/box)是特殊氨基修饰的，能结合50bp-10kb的修饰和未经修饰的DNA。

　　另外CEL公司也提供醛基化修饰的玻片Silylated Slides(Cat.No.CSS-25)。

三、点样样品

　　点样样品的制备是非常关键的一步。样品的纯度、杂交特异性直接决定自制芯片的质量和可信度。可以说，没有好的样品，自制芯片也就没有多大意义。

　　我们在前面介绍了Clontech公司的Atlas系列，其中Glass Array和Plastic Array上那8300个基因对应的80碱基长寡核苷酸序列是经过Clontech公司专利软件在GenBank中筛选出的同源性最低，又经Clontech实验确保能给出很强杂交信号的片断。这种精巧的设计保证很高的分辨率、灵敏度，实在令人印象深刻。现在，你可以通过基因公司定购这些寡核苷酸来制作自己的芯片了。足够点1000次芯片的8327个人类基因、5002个小鼠基因或者将近4000个大鼠基因的寡核苷酸片断（冻干）放在96孔板中，连同100个Type II玻片和杂交盒，200ml杂交液，全面满足中小型实验项目的需求。这些寡核苷酸序列数目齐全，质量可靠，能为自制芯片的灵敏度和分辨率提供可靠的保证，也避免了合成8000多基因的麻烦。还有更大包装可供选择。对Atlas Nylon Array上的200-600bp的cDNA片断感兴趣的研究人员则可以选择Ready-to-Print cDNA 系列，共计5278个人类基因，3197个小鼠基因或者2727个大鼠基因（每个基因片断有3ug，分装在96孔板中），均可定购。

Cat.No.
Product(基因数目)
可点芯片数

CS2006
Human Long Oligos(8327)
1000

CS2007
Mouse Long Oligo(5002)
1000

CS2008
Rat Long Oligo(4000)
1000

CS2009
Human Ready-to-Print cDNA(5278)
3ug/gene

CS2011
Mouse Ready-to-Print cDNA (3197)
3ug/gene

CS2012
Rat Ready-to-Print cDNA(2727)
3ug/gene


　　如果人、小鼠和大鼠的这些Oligo还不能满足你的需要，那么可以选择Operon公司的Array-Ready Oligo Sets。刚被QIAGEN公司收购的Operon公司是世界著名的DNA合成专家，提供包括有酵母基因组、人类基因组、小鼠基因组、疟原虫基因组和肺结核杆菌基因组的Oligo sets。所有的OligoSets都是按最新的数据而设计的。由于测序速度的提升，更多新数据涌现，Operon公司保证以后根据新数据设计的Oligos将以升级试剂盒的形式提供。

　　Yeast Genome Oligo Set里提供斯坦福大学酵母基因组数据库（SGD）中6307个酿酒酵母的开放阅读框中挑选的长度为70-mer单链寡核苷酸和10个对照，所有的序列经过BLAST保证同源性最低，避免非特异杂交。每种Oligo有2000pmol，足够点2000-6000张片。

　　Alaria Genome Oligo Set则包含整个Plasmodium falciparum疟原虫基因组6231个预测的基因或ORF对应的70-mer寡核苷酸，以及138个对照，是由加州大学的芯片专家Dr.Joe DeRisi协助设计的。数据来源是Sanger中心和TIGR以及斯坦福大学。

　　Operon公司也提供Human Genome Oligo Set，包含13971个来源于UniGene中的已知基因对应的70-mer寡核苷酸序列（Hs build 119）和29个对照。（The UniGene database automatically clusters all human Genbank sequences into a non-redundant set of genes. Similar databases are also available for the rat and mouse genomes. Each cluster in the UniGene database represents one unique gene. A cluster may contain many sequences, but one representative sequence has been selected based on the longest region of high-quality sequence data.）

　　Mouse Genome Oligo Set同样包含6868个已知基因对应的70-mer序列，数据来源也是Mouse UniGene Build 83，还有16个对照。每个Oligo的量也是2000pmol。

　　Tuberculosis Genome Oligo Set包含4295个70-mer Oligo，其中大部分是来源于Sanger中心测序的Mycobacterium tuberculosis H37RV (lab strain)基因组中预测的3924个基因，另外371个是来源于TIGR（The Institute for Genomic Research）测序的TB strain CDC-1551中和前者同源性低于97%的预测基因。

　　除了购买现成的核酸，还可以通过自己合成寡核苷酸和PCR扩增模板的方法制备点样样品。由于自己合成Oligo成本太高，只适于少量特殊样品。最常用的还是PCR扩增。一张芯片上可不只10个8个样本，少则上百多则上千个样本的质粒纯化、PCR以及PCR产物纯化，加上芯片上的样品量很有限，点样的纯度必须有保证，所以QIAGEN公司的96孔高通量核酸纯化系列是最好的选择。一次可以纯化96个样品，大大简化了上百个样本纯化的工作量和操作强度。

　　26171 R.E.A.L. Prep 96 Plasmid Kit(4x96)——高通量碱法纯化小量质粒DNA，只需60-75分钟即可纯化96个样品，需要96孔板离心机。

　　27191 QIAprep 96 Turbo Miniprep Kit(4x96)——高通量碱法纯化小量质粒DNA，采用真空抽滤的方法，只需45分钟即可纯化96个样品，无需96孔板离心机。质粒纯度高。
27781 QIAprep 96 M13 Kit(4x96——高通量纯化M13单链DNA，采用真空抽滤的方法，只需45分钟即可纯化96个样品。

　　28181 QIAquick 96 PCR Purification Kit--采用真空抽滤的方法，利用硅胶膜技术25分钟内从PCR反应体系中回收高纯度的DNA，回收率高达90%(100bp-10kb)，可除掉 99.5 %的引物，无需另外去除石蜡油，无需乙醇沉淀，无需酚、氯仿等有机试剂。纯化产物可直接用于芯片点样或测序。

　　Telechem 公司：世界著名的芯片供应商，提供各种芯片方面的耗材和试剂。其PCR产物纯化试剂盒利用高级滤膜技术，具有价格低、通量高、速度快等优点。无需乙醇沉淀，无需酚、氯仿等有机试剂。90%以上的回收率，99.9%的DNA纯度，孔与孔之间的交叉污染小于0.01%，每天可以纯化1000个以上的样品。

Telechem PCR Purification Kits

384-Well PCR Purification Kit

PCR-384-01
Starter Kit (1 x 384)
￥1,320

PCR-384-10
Mini Kit (10 x 384)
￥10,648

PCR-384-50
Midi Kit (50 x 384)
￥48,246

PCR-384-100
Maxi Kit (100 x 384)
￥85,140

96-Well PCR Purification Kit For 25ul PCR Reactions

PCR-25-01
Starter Kit (1 x 96)
￥979

PCR-25-10
Mini Kit (10 x 96)
￥7,084

PCR-25-50
Midi Kit (50 x 96)
￥28,369

PCR-25-100
Maxi Kit (100 x 96)
￥53,218

96-Well PCR Purification Kit for 100ul PCR Reactions

PCR-101
Starter Kit (1 x 96)
￥1,122

PCR-110
Mini Kit (10 x 96)
￥7,788

PCR-150
Midi Kit (50 x 96)
￥31,911

PCR-100
Maxi Kit (100 x 96)
￥56,694

大规模样品纯化

　　对于较大规模制作芯片的用户，由于点样样品数目太多，即使采用这种高通量试剂盒还是不够方便。这时不妨考虑分子生物学的标准工作站--全自动核酸和蛋白纯化工作站。这可不同于那种单一样品大量纯化的系统，而是特别适合芯片制作的很多个样品小量纯化系统。

　　随着人类基因组、功能组的研究不断深入，生物芯片的研究在全世界开展的如火如荼，它已经成为进行大规模分子生物学研究的有利工具。但是在芯片飞速发展的今天，样品制备已经成为芯片发展的瓶颈所在。生物样品往往是各种组分的混合体，成分非常复杂，传统的核酸和蛋白纯化方法需要花费大量的人力、物力、财力，而且许多有机试剂会对人体造成不同的伤害。如今，您再也不用为纷繁复杂的纯化过程而烦恼了，世界上声誉卓著的核酸纯化供应商--QIAGEN公司推出了全自动核酸和蛋白纯化工作站--4个不同的自动纯化系统型号：BioRobot 8000，BioRobot 3000，BioRobot 9604，BioRobot 9600，加上QIAGEN优质的多种配套纯化试剂盒--从质粒、粘粒、RNA、血液基因组DNA、病毒DNA到蛋白，品种丰富，信誉卓著，带着德国人的严谨和自信，在欧美的生物医学市场上掀起了一场革命，各大分子生物学中心、芯片中心、医学中心争相抢购。作为国内最大的生命科学领域内的仪器和试剂供应商，我们有理由，更有责任将这套系统推荐给在生命科学领域内忘我工作的科学家，为大家分忧解难，为促进中国的生物芯片产业发展尽牵线搭桥，为缩小与欧美在生命科学领域内的差距尽一份薄力。

　　BioRobot 8000:

　　专为基因组实验室设计，同时也可以用于其他分子生物学领域。高通量、快速、全自动核酸纯化系统，功能强大的真空过柱、振荡混匀及加热制冷装置，无需离心即可进行核酸纯化。8通道自动移液系统可以对384孔板进行准确、快速地移液处理。

　　特点：

　　1、高通量核酸纯化。
　　2、速度快、全自动样品传送及液面监控。
　　3、高精确处理384孔板。
　　4、提供优质配套试剂，结果重复性好。
　　5、具有功能强大的软件处理系统。
　　6、提供配套的优质试剂

　　BioRobot 3000:

　　此系列为可根据客户的不同需求量身定做的分子生物学平台。自动移液，软件功能强大，用途广泛。主要可以应用于：基因组或质粒DNA，RNA纯化病毒DNA，RNA纯化，6×His蛋白纯化，PCR产物纯化，PCR、测序及其它反应体系准备，Re-arraying。

　　特点：

　　1、根据客户的不同需求量身定做
　　2、灵活的操作系统、满意的结果
　　3、准确的枪头定位系统（根据液面不同）和液体传输系统
　　4、可选择与其他仪器（如分光光度计）连用的自动机械臂
　　5、自动的样品跟踪和过程控制系统（条形码扫描）
　　6、简单易学的软件操作系统
　　7、提供配套的优质试剂
　
　　BioRobot 9604；



　　此仪器是专为临床样品和细胞培养液设计的核酸自动纯化的分子生物学工作站。可自动从临床诊断样品（各种血样，体液，口腔刮离细胞及细胞培养物等）中纯化基因组DNA、质粒DNA、RNA、病毒DNA及RNA，还可进行PCR产物纯化，PCR样品准备。适用于 医院，检验科分子诊断，血库，检疫，海关病毒检测，血液分型，法医DNA指纹鉴定制药公司药物筛选等。

　　特点：

　　满足分子诊断所需DNA的标准的、自动纯化操作过程
　　满意的得率和可信的结果
　　自动的样品跟踪和过程控制系统（条形码扫描）
　　可同时进行2X96样品，且有很好的可重复性
　　可安全处理有传染性的样品
　　配套的高质量试剂
　　简单易学的软件操作系统
　
　　BioRobot9600：

　　此仪器是为常规分子生物学研究设计的核酸纯化工作站。可以进行质粒DNA，RNA纯化病毒DNA，RNA纯化， PCR产物纯化，PCR、测序及其它反应体系准备，Re-arraying。

　　特点：

　　 分子生物学标准的、自动核酸纯化操作过程
　　移液过程中不会造成交叉污染
　　配套的高质量试剂
　　简单易学的软件操作系统

生物芯片入门（四）：基因表达谱芯片实验操作2

杂交

　　互补杂交要根据探针的类型、长度以及研究目的来选择优化杂交条件。如用于基因表达检测，杂交时需要高盐浓度、样品浓度高、低温和长时间(往往要求过夜)，但严谨性要求则比较低，这有利于增加检测的特异性和低拷贝基因检测的灵敏度；若用于突变检测，要鉴别出单碱基错配，需要故需要在短时间内(几小时)、低盐、高温条件下高严谨性杂交。多态性分析或者基因测序时，每个核苷酸或突变位都必须检测出来，通常设计出一套四种寡聚核酸，在靶序列上跨越每个位点，只在中央位点碱基有所不同，根据每套探针在某一特点位点的杂交严谨程度，即可测定出该碱基的种类。
　　
　　杂交反应还必须考虑杂交反应体系中盐浓度、探针GC含量和所带电荷、探针与芯片之间连接臂的长度及种类、检测基因的二级结构的影响。有资料显示探针和芯片之间适当长度的连接臂可使杂交效率提高150倍。连接臂上任何正或负电荷都将减少杂交效率。由于探针和检测基因均带负电荷，因此影响他们之间的杂交结合，为此德国癌症研究院的Jorg Hoheisel等提出用不带电荷的肽核酸（PNA）做探针效果更好。虽然PNA的制备比较复杂，但与DNA探针比较有许多特点，如不需要盐离子，因此可防止检测基因二级结构的形成及自身复性。由于PNA-DNA结合更加稳定和特异，因此更有利于单碱基错配基因的检测。我们在这里简单介绍一些常用杂交试剂和消耗品

　　对于商品化的芯片和Array类产品，通常都有配套的杂交试剂以方便使用。例如：

　　1. Clontech公司的Altas Glass Microarrays，产品已经包含GlassHyb? Hybridization Solution和GlassHyb? Wash Solution，能有效缩短杂交时间，提高信噪比。同时还提供了方便使用的Altas Glass Hybridization Chamber，旋盖式的设计和1.8ml的容积，避免了传统coverslip式杂交盒的弊端。可以单独购买。

7899-1 Altas Glass Hybridization Chamber each
8016-1 GlassHyb? Hybridization Solution 50ml

　　2. Clontech ExpressHyb Hybridization Solution快速杂交液能有效加快杂交速度，减少杂交时间，同时提高灵敏度。适用于各种基于膜的核酸杂交反应，如cDNA Array、Southern、Northern、菌落原位杂交，特别是Clontech公司的Altas系列、MTN系列、MTE系列的各种膜基质的Macroarray。在 这些系列的产品中均配有快速杂交液样品。由于膜可以反复使用，通常需要另外购买快速杂交液。

8015-1 ExpressHyb Hybridization Solution 250ml
8015-2 ExpressHyb Hybridization Solution 500ml

　　3. 对于自己制作的芯片，可以自行配置杂交缓冲液，也可以参考Ambion公司提供的几种Glass Array 杂交缓冲液。SlideHyb? Glass Array Hybridization Survey Kit是专为玻片或者尼龙膜基质的玻片DNA Array优化杂交条件而设计的。由于芯片的杂交条件受多种因素的影响，Ambion认为很难找到一种适用于所有芯片的杂交缓冲液。在这个试剂盒中提供了4种严谨程度不同的杂交液，供不同的需要。1号缓冲液的杂交条件是最严谨的，背景最低，2、3号的灵敏度相应提高而背景也相应升高，4号缓冲液没有去垢剂。这些杂交液可以单独购买，连预先配好的SDS、SSC等常用缓冲液都可以在Ambion买到。毕竟在芯片这样精密的实验中，在这么小的一个点上的DNA的量是非常有限的，要得到理想的结果需要非常精确的反应条件。Ambion 同样提供芯片杂交盒，抗化学腐蚀，耐70度高温，一次可放三张片。

Cat.No. Product Name Size

1860 SlideHyb?GlassArray Hybridization Survey Kit 100rxns
8861 SlideHyb? Glass Array Hybridization Buffer#1 5 x 2 ml
8862 SlideHyb? Glass Array Hybridization Buffer #2 5 x 2 ml
8863 SlideHyb? Glass Array Hybridization Buffer #3 5 x 2 ml
8864 SlideHyb? Glass Array Hybridization Buffer #4 5 x 2 ml
10040 Glass Array Hybridization Cassette 1 each

4. Ambion同样提供适用于各种核酸膜杂交的杂交液和Wash Buffer，精心优化的反应条件有效提高杂交灵敏度和降低背景，已经经过ULTRArray? (Ambion), Atlas?(Clontech)，LifeGrid? (Incyte Genomics), GeneFilter? (Research Genetics), and Panorama? (Sigma-Genosys) arrays等产品验证。

Cat# ProductName Size
7118 Yeast RNA 10 x 10 mg/ml
8665 ULTRArray? Hybridization Buffer 225 ml
8666 ULTRArray? Hybridization Buffer 500 ml
8667 ULTRArray? Low Stringency Wash Buffer 1 L
8668 ULTRArray? High Stringency Wash Buffer 1 L
9680 Salmon Sperm DNA (sheared) 10x10 mg/ml
9763 20X SSC 1 L
9765 20X SSC 4 x 1 L
9780 RNaseZap? 250 ml

图象的采集和分析

　　当生物芯片和样品探针杂交完毕后，就需要对杂交结果进行图象采集和分析。一般膜芯片的杂交都用同位素p32、p33作标记，其信号的检测需通过传统的磷光成像系统来完成。而对于用荧光标记的玻璃芯片杂交后的检测，则需要用专门的荧光芯片扫描仪。

　　1. 磷感屏成像系统Cyclone Storage Phosphor System

　　Cyclone磷屏成像系统为美国Packard公司生产的第一台集高分辨率、高灵敏度和5个数量级的线性范围于一身的计算机控制数字化自动放射成像分析系统，由于其使用方便、快捷、自动化程度、分辨率、图像清晰度均很高，既可定位亦可定量，目前已广泛应用于核医药学、细胞与分子生物学、生物化学、药理学、基因工程学、药物代谢动力学、放射免疫及受体免疫等多方面实验研究，成为十分方便的有力工具。其优异品质主要得益于Packard专利的激光技术和共聚焦成像系统。应用范围为我们前面介绍的DNA Macroarray以及Northern、Southern、Western Blot.，手工测序，放射性原位杂交等的同位素结果检测。使用Cyclon磷屏可以大大缩短研究周期，获得清晰的分辨率。

　　其工作原理在于：同位素标记的杂交结果在磷屏上曝光，曝光过程32P等核素核衰变同时发射β射线，首先激发磷屏上分子，使磷屏吸收能量分子发生氧化反应，以高能氧化态形式储存在磷屏分子中。激光扫描磷屏，对于激发态高能氧化态磷屏分子发生还原反应，即从激发态回到基态时多余的能量以光子形式释放，从而在PMT捕获进行光电转换，磷屏分子回到还原态。计算机接受电信号，经处理形成屏幕图像，并进一步分析和定量。一般化学发光物质如荧光染料标记样品成像过程与放射性类似。

　　系统特点

　放射性自显影成像系统。储存式磷屏根据不同样品厚度、射线能量有多种型号磷屏可供选择，磷屏可以多次重复使用。
　灵敏度较X光片高数十倍，可以检测最弱的信号。曝光时间可以缩短20倍以上。
　快速成像，从对磷屏进行扫描到获得完整的的数字化图像，总共需要不到10min的时间，实时图像显示，同时立即报告分析结果。
　可对放射性位置和强度进行相关的定位、定量分析，宽达105的线性范围，定量准确。
　不需胶片、暗室设备、冲洗底片，一步到位完成分析过程。
　可选配Ouant ArrayTM 软件，用于尼龙膜上同位素标计的Gene Array定量分析。

　　2. 荧光芯片扫描仪

　　由于杂交时产生序列重叠，会有成百上千的杂交点出现在图谱上，形成极为复杂的杂交图谱。序列重叠虽然可为每个碱基的正确读出提供足够的信息，可提高序列分析的可靠性，但同时信息处理量也大大增加了。一般说来，这些图谱的多态性处理与存储都由专门设计的软件来完成，而不是通过对比进行人工读谱。用计算机处理即可给出目的基因的结构或表达信息。扫描一张10cm2的芯片大概需要2-6分种的时间。目前专用于荧光扫描的扫描仪根据原理不同大致分为两类：一是激光共聚焦显微镜的原理, 是基于PMT（photomultiplier tube，光电倍增管）的检测系统（另文介绍）；另一种是CCD（charge-coupled devices，电荷偶合装置）摄像原理检测光子。CCD一次可成像很大面积的区域，而以PMT为基础的荧光扫描仪则是以单束固定波长的激光来扫描，因此或者需要激光头，或者需要目的芯片的机械运动来使激光扫到整个面积，这样就需要耗费较多的时间来扫描；但是CCD有其缺点：目前性能最优越的CCD数字相机的成像面积只有16×12mm（像素为10μm），因此要达到整个芯片的面积20×60mm的话，需要数个数码相机同时工作，或者也可以以降低分辨率为代价来获得扫描精度不是很高的图像。由于灵敏度和分辩率较低，比较适合临床诊断用。

　　生产商业化扫描仪的公司包括：Genomic Solutions公司、Packard公司、GSI公司、Molecular Dynamics、Genetic Microsystems公司、Axon ?Instruments公司等。其中GSI Lumonics 公司ScanArray 系列一直是生物芯片扫描检测系统中的领头产品。2000GSI并入著名的Parkard公司后ScanArray的软、硬件都得到进一步加强。

　 ScanArray利用其专利的激光共聚焦光学系统，通过计算机控制，对生物芯片的荧光杂交信号进行全自动的扫描采集，并通过分析软件对数据结果进行定量分析。

　最高灵敏度高：<0.1荧光分子/μm
　扫描精度可从5μm-50μm分级调整
　全范围扫描时间仅需5分钟，快速方便
　多达十种检测滤光片，涵盖所有生物芯片荧光染料的检测，适用于多种荧光标记探针

　　不同波长依次扫描避免交叉光污染

　　扫描后的图像还需要进一步的处理，这要求一定的软件支持。现有的分析软件包括：Biodiscovery的ImaGene系列，Axon Instruments的GenePix系列，GSI的QuantArray等

3. 基因芯片上各克隆荧光信号的分析原理

　　用激光激发芯片上的样品发射荧光，严格配对的杂交分子，其热力学稳定性较高，荧光强；不完全杂交的双键分子热力学稳定性低，荧光信号弱（不到前者的1/35~1/5），不杂交的无荧光。不同位点信号被激光共焦显微镜，或落射荧光显微镜等检测到，由计算机软件处理分析，得用激光激发芯片上的样品发射荧光，严格配对的杂交分子，其热力学稳定性较高，荧光强；不完全杂交的双键分子热力学稳定性低，荧光信号弱（不到前者的1/35~1/5）（2），不杂交的无荧光。不同位点信号被激光共焦显微镜，或落射荧光显微镜等检测到，由计算机软件处理分析，得到到有关基因图谱。美国GSI ?Lumonics 公司开发出专专业基因芯片检测系统(ScanArray 系列),采用激光共聚焦扫描原理进行荧光信号采集，由计算机处理荧光信号，并对每个点的荧光强度数字化后进行分析。利用QuantArray软件包对扫描的荧光信号进行分析，比

　　较每个克隆在不同组织间表达水平的差别。软件具体分析步骤如下：

　　首先，同时导入同一区域两个channel扫描的图像文件；将两个channel扫描的图像用不同的颜色显示并重叠；选择拟分析的区域，输入矩阵的行数及列数以及矩阵的个数等参数；在计算机给出的该区域信号图片上标定网格，使得网格中所包含的横线和竖线的交点个数同每个区域点样的克隆数相同，调整网格，使每个交点均位于点样克隆信号的中心；信号的中心确定后，计算机将自动以交点为中心，按照设定的半径圈定各克隆，并将其内部区域作为待分析的信号，同时在圈定的各克隆周围再按照预设的值圈定一定范围的区域，将该区域内的信号作为背景噪音；计算机分析每个克隆扣除背景噪音后的信号强度，并按照不同的要求对数据进行分析；利用GenePie方式对两个channel信号的进行定量比较分析，此时计算机根据各克隆两个channel扫描的信号，以饼图的形式给出两个channel信号强度的相对比例，同时可以逐个克隆读取计算机分析出的两个channel信号的值及所占的比例，进而确定各克隆在两种组织间的表达差异。

　　4. Microarray数据分析

　　Microarray数据分析简单来说就是对Microarray高密度杂交点阵图象处理并从中提取杂交点的荧光强度信号进行定量分析，通过有效数据的筛选和相关基因表达谱的聚类，最终整合杂交点的生物学信息，发现基因的表达谱与功能可能存在的联系。

　　Microarray数据分析主要包括图象分析(Biodiscovery Imagene 4.0\Quantarray分析软件)、标准化处理（normalization）、Ratio值分析、基因聚类分析（Gene Clustering）。

　　1. 图象分析：激光扫描仪Scaner得到的Cy3/Cy5图象文件通过划格（Griding），确定杂交点范围，过滤背景噪音，提取得到基因表达的荧光信号强度值，最后以列表形式输出。

　　2. 标准化处理（Normalization）：由于样本差异、荧光标记效率和检出率的不平衡，需对cy3和cy5的原始提取信号进行均衡和修正才能进一步分析实验数据，Normalization正是基于此种目的。Normalization的方法有多种：一组内参照基因（如一组看家基因）校正Microarray所有的基因、阳性基因、阴性基因、单个基因。

　　3. Ratio分析(Ratio Analysis)：cy3/cy5的比值，又称R/G值。一般0.5-2.0范围内的基因不存在显著表达差异，该范围之外则认为基因的表达出现显著改变。由于实验条件的不同，此域值范围会根据可信区间有所调整。处理后得到的信息再根据不同要求以各种形式输出，如柱形图、饼形图、点图、原始图象拼图等。将每个Spot的所有相关信息如位标、基因名称、克隆号、PCR结果、信号强度、Ratio值等自动关联并根据需要筛选数据。每个Spot的原始图象另存文件，可根据需要任意排序，得到原始图象的拼图，对于结果分析十分有利。

　　4. 聚类分析(Clustering Analysis)：实际是一种数据统计分析。通过建立各种不同的数学模型，可以得到各种统计分析结果，确定不同基因在表达上的相关性，从而找到未知基因的功能信息或已知基因的未知功能。Gene Clustering就是根据统计分析原理，对具有相同统计行为的多个基因进行归类的分析方法，归为一个簇的基因在功能上可能相似或关联。目前以直观图形显示GeneCluster结果的程序已有人开发出来，可将抽象的数据结果转化成直观的树形图，便于研究人员理解和分析。

　　尽管基因芯片技术受到了广泛关注，但在基因表达谱分析中起着关键作用的生物信息学却没能引起大家的足够重视，认为简单人工处理一下原始数据就可以得到有价值的生物学信息，大量有价值的信息就这样被浪费和湮没了。可以肯定地说，没有生物信息学的有效参与，基因芯片技术就不能发挥最大效能。加大基因芯片技术中生物信息学的研究开发力度已成为当务之急。国内外已经进行了有益的尝试，初步开发出供芯片平台管理实验数据的软件包，就目前实际情况来看，生物信息学在基因芯片研究开发中介入的程度已经越来越深，主要涉及基因表达信息分析管理系统及其分析工具和分析方法，简单概括为以下几个方面：

　　基因表达数据库

　　基因表达数据库是整个基因表达信息分析管理系统的核心。Microarray数据库起着数据储存和查询、各种相关信息的整合的作用。Microarray数据库可以包含用户的管理信息、原始实验结果（图象文件、信号强度值、背景平均值行列号、基因号等）、各种实验参数（Plates/unigene/Sets/Clusters）、探针相关信息、 clone相关信息（基因名称、基因序列、GenBank accession号、克隆标志符（IMAGE和内部）、代谢途径标志符、内部克隆标志符）、分析处理结果、芯片设计相关的资源和数据，等等。
分析方法：

　　选择分析方法的基本标准：能够简化原始数据，结果直观，使研究者能在海量基因表达数据中解析出正确的基因表达谱和功能信息。一个理想的分析方法是建立在合理的算法基础之上的，应该能全面综合并直观地解析原始数据，修正已有数据，并从结构、序列、功能之间找到新联系。目前已有报道用于microarray数据分析的方法主要有以下几种：

　　手工分类法（Manual classification Method）

　　该方法在Botstein 实验室的Michael Eisen提出新的分析方法之前是唯一用来分析microarray数据的方法。其基本原理是通过对microarray的ratio值从大到小排序，筛出表达显著性改变的基因。结果可直观地从二维plot图得到。优点是能够有效筛选潜在的肿瘤标记基因和药物靶位点；可以构建多组基因诱导或抑制的时间表达谱。缺点是结论过于简单；很难发现更高层次功能线索；处理耗时且不能充分利用数据，也不能发现实验错误。

　　非监督聚类法(Unsupervised Clustering)又称配对平均连锁聚类分析(Pairwise average-linkage cluster analysis)。该方法是分层聚类的一种形式，非常类似系统发生分析。该方法是基于标准相关系数的计算。K -mean方法是unsupervised聚类法的一个变化，目前Stanford University 的Botstein实验室和NHGRI的Trent实验室都采用该分析方法。　

　　混合聚类法(Hybrid clustering approach)该聚类方法通过将每一数据点傅立叶变换寻找那些表达呈周期性变化的基因，比如细胞周期涉及的基因。所谓混合聚类就是先unsupervised聚类再supervised聚类。优点是可以整合以前手工聚类法得到的数据；尤其适合确认细胞周期调控的特征性表达谱。

　　神经网络方法(Neural network approach)运用自组织图（Self organizing maps）并结合supervised法进行聚类。优点是分类标准明确；优化的次序好于其它聚类法；用一种次序风格处理大量数据易于被生物学家接受。

生物芯片（DNA微阵列）荧光扫描仪中的激光共聚焦扫描技术

吴岚君
（北京放射医学研究所 100850）

　　所有的微阵列上的荧光须经荧光扫描装置来分析其上的荧光强度和分布，在这些装置中，激光共聚焦扫描仪具有优越的性能，能获取高质量的图像和数据，本文将分别介绍微阵列的相关特性和各种类型的微阵列扫描仪，激光共聚焦扫描仪的设计和关键特性，另外还将介绍一种已商品化的激光共聚焦荧光扫描装置。

　　微阵列是由分子整齐排列于固相表面，这些分子与荧光分子结合，测定荧光分子的强度后可推知结合分子的浓度。固相部分主要有经过表面化学处理的玻璃片如22mmχ75mm的载玻片。在微阵列上包被的分子常常能与多种荧光探针通过化学键相互作用而联结，通常情况下能联结两种荧光分子，例如在检测不同样品的基因表达的区别时，可将其中一样品（如正常组织）标记上发绿光的荧光分子，将另一种样品如肿瘤组织或发病组织标记上另一种发红光的荧光分子，用两种波长的激光激发微阵列上的样品，通过比较两种荧光在微阵列上某点的比例得知某类基因在两种组织中的差异。

　　微阵列上有样品组成的点阵，除了点之外，余下的是背景。如果玻璃片未经过表面化学处理，样品在玻片上结合不牢固，且容易扩散，造成背景高。若玻璃片经过表面化学处理后，点样的样品在微阵列上结合牢固，点的直径小，不扩散，从而点的密度增加，在进行荧光数据分析时，仪器将点上的荧光强度与点周围的背景强度相比较，如果背景中含有与荧光波段相一致的物质，则背景强度增高，样品的荧光信号将减弱，干扰信号的读取。

　　点阵上的点直径范围为25mm-500mm，通常目前能达到的直径为100mm±50，科学家们正在努力减小直径。因为点直径的变化对扫描结果的读取产生影响，如果点的直径大，荧光分子扩散的范围也大，则观察到的荧光强度相对较弱。

　　若在玻片上有灰尘或其它杂质如衣物纤维、皮屑、指纹等，扫描结果将受到影响。微阵列上的点干燥后形成很薄的层，使得激光共聚焦扫描成为可能，精心地调整扫描仪的焦距，可避免检测出不需要的背景杂质，包括微阵列上的灰尘、玻璃中自带的荧光杂质产生的干扰信号均可通过激光共聚焦的方式将其减少到最低程度。因为杂交因素影响，在微阵列上点与点之间的荧光强度差别很大。对微阵列扫描仪的要求要能够有较宽范围的灵敏度，通常来说，灵敏度调整范围为10000：1。

　　当荧光化合物或染料受到激光激发后将释放出荧光，在某一波长下有一最高释放强度。各种荧光化合物有各自特定的激发吸收值。如图1是FITC的波长对荧光激发强度曲线。从曲线图可见，在494纳米波长下，有一激发高峰，在518纳米下有一释放高峰，释放与激发高峰波长相差24纳米，这一现象在微阵列使用的染料中较普遍。两高峰波长的差值在专业上称之为Strokes shift, 初看曲线图人们可能会以为：FITC在510纳米的波长激发下，在475-510纳米范围内将释放部分荧光，其实并不尽然；释放波长一般情况下大于激发波长，在图中的激发曲线不是与释放曲线同时绘制的，将它们放在同一坐标图中是为了便于观看，其实它们是两套不同的数据。激发曲线的绘制过程如下：在单一长波长下，变换激发波长在不同波长下测定荧光释放强度，释放荧光曲线的绘制过程则是在最长激发波长下开始增加波长，测定在不同波长下的荧光释放强度。微阵列扫描仪设计者通过阅读和分析某中荧光染料的激发曲线和释放曲线来确定适合某种染料的复合扫描激发波长，该波长的激发效率至少要达到50-70%的水平。激发波长要避免太接近释放高峰对应的波长，否则荧光信号受到干扰。所以应在峰值的左边选择一激发波长。如对FITC来说，建议的激发波长在470-495nm.荧光释放强度在某一范围内，与激发光的强度成正比，当荧光释放达到最高峰后，增加激发光强度却不能提高释放强度，因为荧光释放已经达到饱和或光子将染料破坏淬灭。微阵列上各点的荧光分子受到激发后，从各个方向释放荧光光子，散射成球状，所以扫描仪须将这些散射的光子采集到，由于扫描仪的使用的是很低的释放光，几何球状是设计扫描设备的主要根据。

图1 FITC的波长对荧光激发强度曲线

　　微阵列扫描仪可有多种设计类型，但任何类型的微阵列扫描仪都有以下基本功能：

　　激发光

　　激发光的产生源有多种，如激光、氩灯、LEDs或钨丝灯。激发光的波长要避免将释放光的波长覆盖或重叠。对于LEDs或钨丝灯需用滤光器来选择某种特定波长的光。激光的波长单一不需要滤光器来选择某种特定波长的光。灯泡光源可产生多个波长的激发光，通过多个滤光器可选择多种特定的波长以满足激发不同荧光的需要。激发光应直接射向微阵列上的待测样品，通过大量一次照明的方式，待测样品的大部分区域同时受到激发，这种方式在CCD数码相机中较常见，该方式的缺陷是待测样品的受到得激发光不够均匀一致。这点是仪器设计者须考虑到的重要因数之一。另一种方式是：激发光聚焦于样品的很小部分，采用特定的光线采集和定位，聚焦点上的激发光光线密度较高，大约为10000watt/cm2。激发波长的选择是依据染料的激发曲线和释放曲线的峰值来确定的，在染料激发峰值的左边且激发效率较高的范围内，在某种染料水平下，激发效率越低，要达到某种光强，则需要向样品上发射的光越多。过多的发射光将通过光漂白作用破坏样品和污染干扰释放光的信号。

　　释放光采集

　　荧光由目镜的镜头来采集，该镜头聚焦于样品上并将一定区域内的光线收集到装置。收集的角度区域的大小非常关键，荧光释放是球形的，目镜对荧光的采集范围是决定仪器的采集效率关键指标之一。目镜采集光的角度由数值孔径来表示，图2表示了数值孔径与光采集效率之间的变化关系。当数值孔径为1.0时，目镜将收集到整个半球的光，相应的光采集效率为50%。在许多激光共聚焦微阵列扫描仪的数值孔径在 0.5-0.9, 而CCD-扫描仪的数值孔径为0.2-0.5。有其他类型的扫描仪不用目镜而是使用积分球面镜来采集释放的部分光源，但是部分光线经过多次球面反射而衰减。还有一些无散光收集装置，仅仅是将探测器放在样品的某一区域的上方，光线采集的效率受限于样品被照明处的范围及探测器的视角，例如，一个直径为25mm的探测器放在激发点上方100mm处，其实际的有效数值孔径为0.12。图2显示目镜的不同数值孔径与光采集效率的关系。

图2 目镜的不同数值孔径与光采集效率的关系

　　空间定位

　　是指对样品上的某一小区域上的荧光信号进行荧光强度计算，微阵列上的各点样品被分割为许多微小的像素，在进行荧光信号定量时，空间分辨率必须高于个点的大小，如微阵列上各点的直径为100mm，则像素的大小为5-20mm。空间定位可通过多元素探测器，如CCD或机械扫描装置。许多相机设置为大范围照明，探测器直接提供由许多像素组成的图象，该方法的缺陷是CCD提供的目镜数值口径较小，后方照明及维持系统冷却设备价值昂贵，由于光散射会导致像素之间交叉重叠造成信号不够清晰。机械扫描过程包括以下几个步骤：将激发光束聚焦于某一大小同像素差不多的点上，用单一元素的探测器采集那一小点上的释放光。要将整个样品扫描完全，则需移动样品或用一微小的反光镜使激光束移动扫描样品。虽然扫描装置增加了机械装置的复杂程度，但比起CCD相机来，机械扫描可达到的数值孔径更高，有更好的空间选择性，探测器也较便宜些。在低强度的光源下，高光线采集率是至关重要的。

激发/释放分辨

　　微阵列上各点的荧光释放强度通常要比激发光强度弱几个数量级，要从激发光中检测出微弱的荧光信号，就需要对这两种类型的光进行分离，由于光束中的光波长不相同，可利用光波分离将不同的光分开。许多装有目镜的扫描仪采用的是表面照明方式，激发光束与释放光束从样品到目镜经过同样的路径只是方向相反。这种途径使得从样品上反射和散射的光与荧光束混合在一起，所以需要用光束分离器对混合光进行分离。一种类型的光束过滤器是色彩二向或多向过滤器。它将激发光束反射并把释放光束以一较长的波长传输。这种滤光器对一、二或三种不同的激发/释放光都可进行较好的分离，但若超过四种以上的混合光束则分离有困难。另外一种类型的光线分离器称为几何光线分离器，如图3所示，在扫描系统中，目镜的数值孔径为0.6，像素的大小为10mm，从目镜出来的激发光束比释放光束细，一个小反光镜将激光束反射但是让环形部分的释放光束通过，其分离效果与波长光束分离器相同。从理论上来说，光束分离器可以完全将激发和释放光束分开，但实际上并非如此，通常在探测器前放滤光片过滤释放光束。这些滤光片只允许染料的释放高峰附近很窄的一段波长的光通过，而其他波长的光包括激发光都被阻挡了。这是微阵列扫描仪必需的的第二道光束分离装置。有的扫描仪不用光束分离器而是将激发光束和释放光束放在不同的轴上。该方法能将释放光路径的激发光发射回去，但却难以达到较高的数值孔径，因为目镜离样品很近，通常小于1毫米，所以激发光束能进入目镜的角度范围很小。其他具有区分不同波长光束的装置有棱镜、光栅等，这些装置还可产生一些特殊的作用如连续的光波调谐功能。然而，在微阵列中，由于要求对激发光有高度的敏感性，因而对释放光装置也相应要求有很高的精密度。

图3 在上位照明扫描仪中的光束分离器

　　检测荧光扫描仪的探测器

　　将微弱的荧光信号转化为电信号,在微阵列扫描仪中的光线探测器有：光电倍增管、CCD点阵探测器、雪崩光电二极管。各种装置有其优点也有其缺点。不同检测范围的仪器要根据它们各自的特点来选择合适的探测装置。光电倍增管在可见光波范围内是最灵敏的探测器，它属于单点探测器并要求扫描系统对微阵列上的样品进行空间定位，通过改变电压可以很方便地改变光电倍增管的灵敏度。光电倍增管的灵敏度在红外及近红外波长范围内降低得很快，所以它们的用途主要限制在可见光波长范围内。CCD对微弱信号的放大功能不及光电倍增管，因而需要额外的放大系统来将信号放大才能达到光电倍增管的灵敏度范围的上限。其主要的缺点是：CCD探测器的实际数值孔径难以达到06-09的范围,在低亮度背景下,限制微弱信号被检测出来, 另外CCD探测器不能与共聚焦系统相兼容;但是在高亮度背景下, 因为CCD探测器有内置式扫描功能,其优越性就体现出来了。

　　所有的微阵列扫描仪都有固定和放置微阵列固相基质的装置，我们称之为扫描仪的载样盒。载样盒要有能够容纳下玻片的空间，组成其的材料应能经受的住上千次取放样品的刮擦考验。通常微阵列的固体介质为显微载玻片，还有塑料片，但是塑料片不如玻璃片刚硬，容易变形，不易聚焦准确，所以多数研究者使用的是显微载玻片。扫描检测时通常是在室温下进行，此时玻片上各点样品已经干燥，然而，有些染料如FITC在潮湿的环境下才能释放出强烈的荧光，所以研究者们在待测样品上滴加适量的缓冲液，然后盖上盖玻片进行观察。这就需要载样盒能够容纳载玻片与盖玻片叠加之后的厚度，扫描仪在扫描时聚焦于盖玻片下的那一层平面进行扫描。

　　以下要介绍共聚焦扫描微阵列的工作原理，顾名思义，共聚焦扫描仪将视野中的两个聚焦点的影象装配为二维图象，工作过程如所示：平行的激光束通过光束分离器后进入目镜，目镜采集到部分球状散射的荧光释放光并使这些光成为平行的光束，此外还采集被反射的激光，这些激光的强度要比荧光强度大3-7倍。采集回来的光束再次通过光束分离器，光束分离器将大部分激光反射回激光源处，并允许大部分荧光束通过光束分离器，一面平面镜将荧光束反射到释放光栅处，光栅选择很窄范围波长的光通过，并将剩余的激光激发光全部反射回去。共聚焦的工作特点体现在探测目镜和开了一个针孔大的孔的光线挡板上，探测目镜将平行光聚集为很小直径的一束光之后，挡板上的小孔只允许聚焦的光线通过并将其余的光遮挡住。图5显示若发光点不在目镜焦点范围内，则光线将被探测目镜聚集于挡光板前，散射之后大部分光线被遮挡了，只有焦点范围内的光线才能有效地进入当光板的小孔被探测器检测到。对焦距范围的严格限制使得灰尘或近表面的小颗粒均不能成像被探测到，因而共聚焦扫描仪获得图象的信噪比要高于非共聚焦扫描装置。但另一方面，对焦距范围的严格限制要求载玻片摆放非常平稳，扫描运动过程中载样盒要保持在同一水平面上，偏差要小于焦距的范围，偏差小于±10mm。这一要求增加了机械加工的精密度，使得加工工艺更加复杂，但这是保证获得最佳图象质量的有效途径之一。

图4共聚焦扫描的工作原理

图5目镜焦点范围之外的光线被遮挡

　　由于激光共聚焦于载玻片上的一点上,要获得整张玻片上的各点的荧光信息则要对玻片各点进行扫描成像。可通过移动扫描器或移动目镜和载玻片来实现上述功能。扫描器移动后要求目镜能采集到荧光释放光束，这样的目镜很复杂且数值孔径不超过0.3，较为简单的并且采集光效率高的办法是移动目镜或载玻片，但移动的物体大势必影响扫描速度。不过在弱光环境下，图象读取速度取决于探测到的光子的累积量，所以即使扫描速度快而光采集效率低的话图象读取信号也未必快。

　　所有的扫描仪都会面临同样的一个问题，即如何将背景降低并提高待测样品的信号。共聚焦技术的应用使得共聚焦扫描仪能比其它类型的扫描仪获得更高质量的图像信号。在共聚焦扫描仪中有光束分离器及释放光栅将荧光信号分离并传输给探测器，而将激发光和杂质产生的光反射回去并阻挡它们到达探测器。探测器是光电倍增管，其灵敏度高，可探测到一个光子的存在，光电倍增管内的功率放大器可将光信号转化为电信号并放大100万倍，通过调整电压输出可改变光电倍增管的灵敏度范围，微阵列上不同样品的制备过程导致对仪器灵敏度要求不同，内置式的可调灵敏度装置恰好可适应这些不同的变换。传统的硅探测器如PIN光电二极管，没有内置放大装置，在可见光范围内灵敏度很低，因而需要外置的功率放大器，这就增加了杂讯，降低了信噪比。硅探测器在800-900nm范围内有一波长应答高峰，因此用它们探测近红外范围的染料较为理想。光电倍增管通常在500nm左右范围内有一波长应答高峰，高于650nm后则灵敏度迅速降低。它们适用于大部分可见光范围的染料。

　　微阵列扫描仪灵敏度范围要求：在微阵列样品制备过程中，步骤较多，如PCR反应、杂交反应条件变化多、试剂存储条件不同、不同类型的基因表达等因素的影响，即使适用相同的染料，其亮度也可能相差1000倍，在同一快微阵列上的荧光强度范围可达到4000:1的范围。大部分扫描仪的荧光强度读取范围在4000-16000，若不改变仪器的灵敏度范围，就无法适应各种荧光强度样品的读取。调整仪器灵敏度范围的方法有两种：其一是改变激发光的强度，用激光衰减器可调整改变激发光的强度其可调范围至少为100：1。其二是改变光电倍增管的灵敏度，通过变化输入电压的大小，光电倍增管的灵敏度改变范围至少为100：1。两项调整方式可相互叠加使得仪器的调整范围增加到10000：1，这一范围对普通的扫描仪都足够了。通常人们希望使用的激光强度大而不破坏样品上的荧光分子，我们已经知道，激光强度越大激发的荧光光子越多，信号也越清楚和强烈。但是若样品经过多次扫描后，被破坏的荧光光子将增加，所以要将荧光强度降低以防样品上的荧光淬灭。

　　信号转换及采样过程：由被激发的荧光染料产生的光学信号将通过一系列过程转变为数码信号。荧光信号是由一系列随机的光子释放累加而成。若将它们累计可与某一样品区域的染料分子的密度相关。通常扫描仪对空间上和时间上探测到的荧光光子的数量都加以累计并取平均值才能代表某一样品区域的染料分子的密度。被扫描的区域被分为大小相同的像素。激光共聚焦和其它点-照明式扫描仪对逐个像素进行激发，然后探测器累加各像素点上荧光释放分子。将光信号转化为电信号并数值化。各像素的数码分辨率可达到16-比特，当扫描图像正在进行时，显示器要显示图像以供扫描者作初步的分析，扫描过程结束后可将图像保存为图像格式文件如TIFF格式，这种格式的图像文件时目前用途较广的一种图像文件。

　　控制和自动化系统是由电脑来完成的。扫描仪使用者无须精通扫描仪的光学和电子学部分，已商品化的扫描仪已经经过大量的测试和信息反馈并不断地改进，使其用户界面越来越友好，图形化的操作界面使得初学者只需接受简单的训练或阅读操作手册就能够使用仪器。控制软件具有许多自动设置功能，为使用者节省时间提高工作效率。如：不同的用户扫描不同样品可设置、保存、再现扫描参数；可自动设定2个以上的扫描激光波长并自动保存图像结果；对某一扫描波段自动调整灵敏度、激发光强度、及探测器探测范围等。

　　扫描仪各部件功能参数主要如下：

　　激光源的数目和荧光波段 第一代微阵列扫描仪通常是两个或四个荧光波段及两个激光光源，而第二代仪器则含三或四个激光光源并可选择10种荧光波段。

　　另外，分辨率、灵敏度、扫描速度、扫描视野、扫描图像定位的准确程度等指标也是设计和制造微阵列扫描仪所需考虑的技术指标。微阵列扫描仪之间的比较是一个复杂的过程,不应仅仅对单个性能参数进行比较，通常需要对扫描样品进行综合测试。

　　ScanArray共聚焦微阵列扫描仪

　　General Scanning ,Inc.公司已经建立了ScanArray共聚焦微阵列扫描仪的生产线，目前全世界的许多生物技术和遗传基因组分析实验室都在使用该种仪器进行科研工作。

　　ScanArray的结构组成是：样品载体移动、光源固定、多个激光头的共聚焦扫描仪。数值孔径可达0.75，扫描速度达20线/秒。

　　ScanArray共聚焦微阵列扫描仪优越性能表现在：操作简单、体积小，数值孔径高、扫描速度快，灵敏度和分辨率高。

　　目前有两种型号：ScanArraya3000和ScanArraya5000，它们的性能如下：

性能指标
ScanArray3000
ScanArray5000

结构
样品载体移动、光源固定、多个激光头
样品载体移动、光源固定、多个激光头

数值孔径
0.75
0.75

载样介质
所有标准的1''′3''显微载玻片
所有标准的1''′3''显微载玻片

视野
不小于22mm′60mm
不小于22mm′60mm

扫描速度
6线/秒
20线/秒

分辨率
10；50（预扫描）
5，10，20；30；50（预扫描）

激光束
两种（543nm和633nm）
四种（488nm，514nm，543nm，594nm，612nm，633nm）

释放光波段
2
10

输出格式
16-bit 1
16-bit 1

体积
25"长′10.5"宽′11.5"高
30"长′15.5"宽′13.5"高

重量
35
60-70(取决于激光头的数目)


　　参考文献：
Ormerod，M.G.（ed.）. In Flow cytometry： a practical approach，P, 29. IRL Press.
Tomei, L.D.(1988). US Patent 4758727.
Kain, R. C.(1998). US Patent 5719391.
Kain, R.C.,

基因芯片在临床应用中的前景

中华基因网技术部 王嘉嘉

　　基因芯片及其技术是融微电子学、生物学、物理学、化学、计算机科学为一体的高度交叉的新科技，一旦被广泛应用与临床，它将在一些重症传染病、恶性肿瘤、自身免疫性疾病、神经性疾病等方面，发生巨大的革命性的变革，基因技术在疾病的诊断、检测及治疗用药等方面有广阔的应用、研究价值。

　　一、基本概念

　　基因芯片(gene chip)，又称DNA芯片，是指将许多特定的寡核苷酸片段或基因片段作为探针，有规律地排列固定于支持物上，样品DNA/RNA通过PCR扩增、体外转录等技术掺入荧光标记分子，然后按碱基配对原理进行杂交，再通过荧光检测系统等对芯片进行扫描，并配以计算机系统对每一探针上的荧光信号作出比较和检测，从而迅速得出所要的信息[1]。基因芯片技术具有多样品并行处理能力、分析速度快、所需样品量少、污染少等优点，近年来在临床诊断、药物筛选、指导临床用药及治疗等研究领域带来革新性的影响。

　　二、基因芯片的主要类型　

　　基因芯片的类型按分类方法不同可分为不同的类型[2]

　　1、无机片基和有机合成物片基的基因芯片　
以基因芯片的片基或支持物的不同可以分为无机片基和有机合成物片基，前者主要有半导体硅片和玻璃片等，其上的探针主要以原位聚合的方法合成；后者主要有特定孔径的硝酸纤维膜和尼龙膜，其上的探针主要是预先合成后通过特殊的微量点样装置或仪器滴加到片基上。另有以聚丙烯膜支持物用传统的亚磷酰胺固相法原位合成高密度探针序列。

　　2、原位合成和预先合成然后点样的基因芯片 　

　　以探针阵列的形式分为原位合成与预先合成然后点样两种。芯片制备的原理是利用照相平板印刷技术将探针排列的序列即阵列图"印"到支持物上，在这些阵列点上结合上专一的化学基因。原位合成主要是指光引导合成技术，该技术是照相平板印刷技术与固相合成技术、计算机技术以及分子生物学等多学科相互渗透的结果。预先合成然后点样法在多聚物的设计方面与前者相似，合成工作用传统的DNA 合成仪进行。合成后再用特殊的点样装置将其以较高密度分布于硝酸纤维膜或经过处理的玻片上。

　　3、基因表达芯片和DNA测序芯片　

　　根据芯片的功能可分为基因表达谱芯片和DNA测序芯片两类。基因表达芯片可以将克隆到的成千上万个基因特异的探针或其cDNA片段固定在一块DNA芯片上，对来源于不同的个体(正常人与患者)、组织、细胞周期、发育阶段、分化阶段、病变、刺激(包括不同诱导、不同治疗手段)下的细胞内mRNA或反转录后产生的cDNA进行检测，从而对这些基因表达的个体特异性、组织特异性、发育阶段特异性、分化阶段特异性、病变特异性、刺激特异性进行综合的分析和判断，迅速将某个或几个基因与疾病联系起来，极大地加快这些基因功能的确定，同时可进一步研究基因与基因间相互作用的关系。DNA 测序芯片则是基于杂交测序发展起来的。其原理是，任何线状的单链DNA或RNA序列均可分解成 一系列碱基数固定、错落而重叠的寡核苷酸，又称亚序列(subsequence)，假如我们能把原序列所有这些错落重叠的亚序列全部检测出来，就可据此重新组建出原序列。　　

　　另外也可根据所用探针的类型不同分为cDNA微阵列(或cDNA微阵列芯片)和寡核苷酸阵列(或芯片)，根据应用领域不同而制备的专用芯片如毒理学芯片(Toxchip)、病毒检测芯片(如肝炎病毒检测芯片)、P53基因检测芯片等。

　　又可以按生物化学反应过程分：　　

　　通常的生物化学反应过程包括三步，即样品的制备，生化反应、结果的检测和分析。可将这三步不同步骤集成为不同用途的生物芯片，所以据此可将生物芯片分为不同的类型。例如用于样品制备的生物芯片，生化反应生物芯片及各种检测用生物芯片等。

　　三、临床上的应用前景

　　1、疾病诊断

　　基因芯片在感染性疾病、遗传性疾病、重症传染病和恶性肿瘤等疾病的临床诊断方面具有独特的优势。与传统检测方法相比，它可以在一张芯片同时对多个病人进行多种疾病的检测，无需机体免疫应答反应期，能及早诊断，待测样品用量小；能特异性检测病原微生物的亚型及变异；可帮助医生及患者从"系统、血管、组织和细胞层次（通常称之为'第二阶段医学'）"转变到"DNA、RNA、蛋白质及其相互作用层次（第三阶段医学）"上了解疾病的发生、发展过程，这些特点使得医务人员在短时间内，可以掌握大量的疾病诊断信息，这些信息有助于医生在短时间内找到正确的治疗措施。众所周知，肿瘤和遗传疾病发生的根本原因是由于遗传物质发生了改变，检测基因突变对于阐明肿瘤及遗传病的分子机制、疾病的早期诊断具有重要意义。目前，Affymetrix公司已开发出P53基因芯片，是将已知P53基因全长序列和已知突变的探针固定在芯片上，这将有助于恶性肿瘤的早期诊断。华盛顿大学的分子生物学系与病理系联合研究了卵巢癌中基因表达谱的变化[3]，他们将5766个基因探针固定于芯片上，其中5376个分别选自卵巢癌、卵巢表面上皮细胞及正常卵巢的cDNA文库，另外还有342个来自EST克隆，包括一些已知确定的管家基因、细胞因子和因子受体基因、生长因子和受体基因、与细胞分裂相关的基因以及新近确定的肿瘤相关基因，找出在卵巢癌组织中过度表达的30个有GenBank收录的基因，如高表达的有CD9(GenBank录入号：M38690)、Epithelial glycoprotein (GenBank录入号：M32306)、P27（GenBank录入号：X67325）等，这证明了利用基因芯片分析复杂生物体系中分子变化的可行性。又如，Hacia等［4］在1.28 cm×1.28 cm的芯片上固定了9.66×104个长度为20 nt的寡核苷酸探针，用于检测乳腺癌基因BRCA1的exon11 (3.45 kb)中所有可能的碱基置换、插入和缺失(1～5 bp)突变。在15例患者样品中，发现有14例有基因突变，类型包括点突变、插入及缺失等；在20例对照样品中均未检出假阳性结果。又如，Heller等[5]采用基因表达谱芯片研究了类风湿关节炎、肠炎基因的特征性表达活性，发现已知炎症相关基因，如肿瘤坏死因子、白介素和粒细胞集落刺激因子在组织中有表达。还发现一些以前未知的与炎症相关基因的表达，如人基质金属弹性蛋白酶(human matrix metallo-elastase)和黑素瘤生长刺激因子(melanoma growth stimulatory factor)。同时，与一个来自外周血基因文库的1046个cDNA克隆的阵列作这两种病变状态基因差异表达的比较，发现在类风湿关节炎组织中金属蛋白酶组织抑制物1，铁蛋白轻链和锰超氧化物歧化酶表达明显升高 。通过该研究，确定了许多基因与这两种病变的关系，为探讨基因芯片在诊断感染性疾病方面提供了新的思路。现在，肝炎病毒检测芯片、多种恶性肿瘤相关病毒基因芯片等多种芯片已面市，相信不久的将来，会有更多的基因芯片用于临床。

　　2、药物筛选

　　芯片技术具有高通量、大规模、平行性等特点可以进行新药的筛选，尤其对我国传统的中药有效成分进行筛选。基因芯片对于药物靶标的发现、多靶位同步高通量药物筛选、药物作用的分子机理、药物活性及毒性评价方面都有其它方法无可比拟的优越性，能够从基因水平解释药物的作用机理，可以用基因芯片分析用药前后机体的不同组织、器官基因表达的差异，国外几乎所有的主要制药公司都不同程度地采用了基因芯片技术来寻找药物靶标，查检药物的毒性或副作用。例如，Kapp U等[6]用包含950个基因探针的基因芯片比较何杰金氏病细胞系L428及KMH2与EB病的B淋巴细胞系LGL-GK的基因表达谱，发现何杰金氏病源的细胞系中白细胞介素-13（IL-13）及白细胞介素-5（IL-5）表达异常增高，用IL-13抗体处理何杰金氏病院源细胞系可显著抑制其增殖，此发现提示，IL-13可能以自分泌形式促进何杰金氏相关细胞增殖,IL-13及其信号传导途径可能成为何杰金氏病治疗及药物筛选的新靶点。芯片用于大规模的药物筛选研究可以省略大量的动物试验，缩短药物筛选所用时间，这可大大节省新药开发经费，并且可对由于不良反应而放弃的药物进行重新评价，选取可适用的患者群，实现个性化治疗。Michael Wilson 等[7]使用包含有肺结核杆菌基因组PRF的97%的序列的基因芯片，对应用抗结核杆菌药物异烟肼诱导前后表达的变化，结果证明肺结核杆菌中脂肪酸合成酶Ⅱ、FbpC、efpA、fadE23、fadE24和 基因发生改变与耐药性有关，并为新药物作用的靶目标研究及指导抑制这些靶目标试剂和药物的合成提供指导。研究各种药物对不同基因的作用，从而在剂量和成分搭配上做到精确无误。相信在不久的将来，药品说明书上的适用症和禁忌症都会改为适用基因型和禁忌基因型，使得药品更加针对不同个体的不同疾病，达到疗效更佳、副作用更小的目的。

3、指导用药及治疗方案

　　种族、个体等因素都会导致遗传背景的差异，临床上，同样剂量的药物对于不同患者在药物疗效与副作用方面会有很大差异，如果利用基因芯片技术对患者进行诊断再开处方，就可以对患者实施个体化治疗。疾病一般不是由单个基因引起的， 在治疗中很多同种疾病的具体病因是因人而异的，所以用药也因人而异，例如，现用于治疗ADIS的药物[8]主要是病毒逆转录酶RT和蛋白酶PRO的抑制剂，但在用药3-12个月后常出现耐药，其原因是rt、pro基因产生一个或多个点突变，对药物的耐受能力成倍增加，如果将这些基因突变部位的全部序列构建为DNA芯片，则可快速地检测患者是哪些基因发生突变，从而可对症施药，指导临床治疗和预后。传统的中医药讲究的是整体治疗观，在中药基因组学和中药化学组学中，多成分、多靶点治疗是基点，关键就是分析出成分谱与活性谱，实现精确筛选和配置，?quot;复方"的形式作用于致病基因组。

　　4、预防医学

　　在婴儿出生前，可用生物芯片进行有效的产前筛查和诊断，防止患有先天性疾病的婴儿出生。而在婴儿出生后，即可采用基因芯片技术来分析其基因图谱，不仅可预测出他日后可以长多高，还可预测其患某些疾病的潜在可能性有多大，以便采取预防措施。

　　四、前景展望

　　尽管基因芯片发展时间不长，迄今在医学研究实际应用中的例子还不多，但由于芯片技术与传统的杂交技术相比，有检测系统微型化，对样品的需要量非常少，效率高，能高通量检测DNA序列，更好地解释基因之间表达的相互关系及检测基因表达变化的灵敏度高等优点，基因芯片在医学上的应用前景无疑是非常广阔的。但目前基因芯片还处在研究阶段，要成为临床可以普遍采用的技术仍有一些问题急待解决，随着研究的不断深入和技术的更加完善，基因芯片一定会在生命科学研究领域发挥出其非凡的作用。基因芯片技术将为我们提供一条认识生命本质的捷径。

　　参考文献

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生物芯片技术诊断病毒性肝炎研究现状

　　 生物芯片是指通过微加工技术和微电子技术，在固体芯片表面构建微型生化分析系统，将大量特定序列和核酸片断或蛋白有序地固定在载体上，与标记好地待检核酸或蛋白分子进行反应，通过检测荧光信号的强弱而判断样本中的靶分子数量，从而实现对化合物、核酸、蛋白质、细胞及其他生物组分的准确、快速和大信息量的筛检。它具有高度平行性、多样性、微型化和自动化的特性，以往常用的任何方法都难以与之相比较。 自1996年世界第一块商品化的生物芯片问世以来，短短数年间即得到迅猛发展，目前常用的有生物芯片、蛋白质芯片和芯片实验室三大类，主要应用于蛋白质组分研究、药物筛选、疾病诊断与预测、基因表达谱分析、新基因的发现、基因突变检测及多态分析、基因组文库作图及基因测序等。这一技术在病毒性疾病的诊断及疗效评价中也得到了广泛的应用，为临床诊断、用药、疗效判定及疾病的发生、发展与转归提供可靠依据。由此可以更深入地认识病毒的分子致病基础机制，发现更多的、更有效的阻断病毒感染途径和抗病毒作用靶标，以便从分子水平制定实验诊断与临床治疗方案。兹以肝炎病毒为例就近年的研究进展简介如下:

　　用于病毒免疫标志物的平行检测与血清学分型。

　　目前已发现数十种病毒可引起肝炎性损害，检测其相应的免疫标志物在人体中的存在及含量，对病因诊断与治疗意义重大。最新发展的蛋白质芯片技术原理类似于常规的酶联免疫反应原理，即将特异性抗原或抗体固定于载体，待测样本按比例稀释后与其上的抗原或抗体进行反应，在加上荧光标记的抗原或抗体，用计算机软件对荧光信号进行分析，即可获得准确的定性或定量结果。一张芯片上可分布上千甚至数万个抗原或抗体，并能标记多种载光素，使之能同时倍快速检测，且可进行病毒的血清学分型。

　　用于肝炎病毒的分类、分型、变异和定量检测

　　为遴选抗病毒药物，评价临床疗效，除生化、免疫和病理指标外，还应明确病毒的核酸结构和体液病毒核酸的含量，用DNA测序、PCR等法虽可达到目的，但技术难度和实验成本限制了其应用。基因芯片则可对所有的肝炎病毒的分型、变异、突变和病毒核酸含量进行高通量、平行检测。它将待测病毒基因（DNA或是mRNA）经体外转录、PCR、逆转录、末端标记等处理成标记有荧光分子的核酸分子，然后与芯片上的探针进行杂交，用计算机对杂交信号进行处理，依信号和强度即可得出核酸含量。这一方法简便易行，实验成本低，可为临床的准确诊断、合理用药、判定预后提供切实可信的依据。

　　用于病毒的耐药性突变检测

　　目前在肝炎的抗病毒治疗中产生的病毒耐药突变，最典型者为拉米夫定（3TC）抗HBV治疗中出现的YMDD变异。此变异发生于应用3TC半年后，作用靶位为病毒的DNA聚合酶（DNAP）通过与底物竞争结合位点以抑制HBV底逆转录和复制，同时易引起DNAP的多位点突变。基因芯片的高通量、平行检测技术针对引起YMDD变异的众多基因突变位点设计探针，将之结合于同一张芯片或与上述分型基因芯片合并，从血清样本中抽取病毒DNA，经体外扩增后与芯片探针杂交，依据杂交信号判定HBV的YMDD变异，得出是否产生耐药性的结论。

　　结合核酸类抗体配基筛选技术（SELEX），实现基因芯片技术对肝炎免疫应答中特异性标志物及相关蛋白质的分析

　　随着DNA结合蛋白研究的深入，受组合化学、抗体库和随机噬菌体肽库技术的启发，人们构建了随机核酸库并从中筛选出与靶蛋白特异结合的核酸配基，此技术称为SELEX。与蛋白类抗体相比，此配基具有许多有点：作用的靶分子范围更广，配基与靶分子的结合能力与特异性更强，动力学参数可依体外诊断条件的要求而改变，不受抗原毒性和免疫原性的限制，特异性和亲和力不受组织或样本中非靶抗原的干扰，体外人工合成实现标准化生产，合成时可随意连接其他功能基因和分子等。目前已从核酸库中筛选出各种与蛋白、核酸、小分子肽、氨基酸、有机物、金属离子等特异性结合配基，并应用于临床治疗和诊断。凡涉及抗体的诊断领域，几乎均可用核酸配基替代。选择针对肝炎免疫应答过程中特异性标志物及相关反应蛋白筛选核酸配基，人工合成后结合于固相载体，制作基因芯片，即可实现芯片技术的病毒免疫标记物及免疫应答过程中的细胞因子、细胞周期、细胞凋亡等免疫学检测。

　　 基因芯片技术虽有诸多优点，但要成为实验室或临床可以普遍采用的技术目前尚有一些关键问题亟待解决，如如何提高芯片的特异性，简化样本制备和标记操作程序，增加信号检测的灵敏度和高度集成化样本的制备，基因扩增，核酸标记及检测仪器的研制和开发等，已成为当今国内外研究的热点。

摘自：《中华基因网》

生物芯片技术在药物R&D中的应用

　　1946年世界上第一台电子数字计算机ENIAC在美国Pennsylvania大学问。在随后的50年里，以美国的硅谷为摇篮，计算机技术不断飞速发展，给我们的生活带来了巨大的变革。无独有偶，1991年又是在美国硅谷，Affymax公司开始了生物芯片的研制，他们将芯片光刻技术与光化学合成技术相结合制作了寡核苷酸阵列芯片。近年来，以DNA芯片为代表的生物芯片技术，得到了迅猛发展，已有多种不同功能的生物芯片问世。目前生物芯片技术已应用于分子生物学、疾病的预防、诊断和治疗、新药开发、生物武器的研制、司法鉴定、环境污染监测和食品卫生监督等诸多领域，已成为各国学术界和工业界所瞩目并研究的一个热点。

　　生物芯片的概念源自于计算机芯片，狭义的生物芯片即微阵列芯片，主要包括cDNA微阵列、寡核苷酸微阵列、蛋白质微阵列和小分子化合物微阵列。分析的基本单位是在一定尺寸的基片（如硅片、玻璃、塑料等）表面以点阵方式固定的一系列可寻址的识别分子，点阵中每一个点都可以视为一个传感器的探头。芯片表面固定的分子在一定的条件下与被检测物进行反应，其结果利用化学荧光法、酶标法。同位素法或电化学法显示，再用扫描仪等仪器记录，最后通过专门的计算机软件进行分析。广义的生物芯片是指能对生物成分或生物分子进行快速并行处理和分析的厘米见方的固体薄型器件，其主要种类有微阵列芯片、过滤分离芯片、介电电泳分离芯片、生化反应芯片和毛细管电泳芯片等。
随着21世纪的到来，制药公司正面临着一次严峻的市场挑战。这些公司为了保持或增强在市场上的竞争力，不得不寻求发展新的药物开发技术以提高药物发现的速度，缩短新药上市的时间，减少药物开发的成本。近年来生物芯片技术的飞速发展，引起了制药业的极大兴趣，使得生物芯片技术在药物研究与开发领域得到越来越广泛的应用，已逐渐渗入到药物研发过程中的各个步骤。本文将主要讨论生物芯片技术在药物靶点发现与药物作用机制研究、超高通量药物筛选、毒理学研究、药物基因组学研究以及药物分析中的应用。

　　1 生物芯片在药物靶点发现与药物作用机制研究中的应用

　　药物靶点发现与药物作用机制研究是生物芯片技术在药物研发中应用最为广泛的一个领域。在药物靶点发现和药物作用机制研究中所使用的生物芯片主要是指DNA芯片。在DNA芯片的表面，以微阵列的方式固定有寡核苷酸或cDNA。使用DNA 芯片可以对研究者感兴趣的基因或生物体整个基因组的基因表达进行测定。在当代药物开发过程中发现和选择合适的药物靶点是药物开发的第一步，也是药物筛选及药物定向合成的关键因素之一。人体是一个复杂的网络系统，疾病的发生和发展必然牵涉到网络中的诸多环节。当今严重威胁人类健康的心脑血管疾病、恶性肿瘤、老年性痴呆症和一些代谢紊乱疾病都是多因素作用的结果，往往不能归结于单一因素的变化。应用一些基因寻找策略如DD PCR等虽然为发现新的功能基因提供了一些线索，但还是有相当的局限性。而DNA芯片可以从疾病及药物2个角度对生物体的多个参量同时进行研究以发掘药物靶点并同时获取大量其他相关信息。因此可以说，在这种情况下，任何一元化的分析方法均不及 DNA芯片这种集成化的分析手段更具有优势。

　　DNA芯片在药物靶点发现与药物作用机制研究中的应用具体表现在以下几个方面。

　　比较正常不同组织细胞中基因的表达模式

　　基因的表达模式给它的功能提供了间接的信息。例如只在肾脏中表达的基因就不大可能与精神分裂症有关。一些药物的靶点是在整个身体中分布广泛的蛋白质，这类药物的不良反应往往比较大。而选择只在特异组织中才表达的蛋白作为药物筛选的靶点，可以减少药物对整体产生的不良反应，因而更引起人们的关注。例如骨质疏松症（osteoporosis）与破骨细胞（osteoclasts）的功能有关，破骨细胞可以破坏并吸收骨质，当骨质的形成与破坏出现不平衡的时候，就会导致骨质疏松症。如果破骨细胞的功能得到抑制，那么就可以控制骨质疏松症的发生和发展。利用已有的人类EST序列和DNA芯片技术，可以容易地得到只在破骨细胞中进行表达的基因如 cathepsink基因，它编码半胱氨酸蛋白酶。以 cathepsink基因作为靶标，筛选对它有抑制作用的药物，就有可能得到治疗骨质疏松症的药物。但是这种方法也有其局限性，它只能得到mRNA水平的表达谱，另外组织一般由多种细胞组成，而要将这些细胞分离很困难。

　　研究正常组织与病理组织基因表达差异

　　正常组织在病变的过程中，往往伴随着基因表达模式的变化。基因表达水平的升高或降低，可能是病变的原因，也可能是病变的结果。若基因表达的变化是病变的原因，则以此基因为靶点的药物就可能逆转病变；若基因表达的变化是病变的结果，则以此基因为靶点的药物就可能减轻病变的症状。DNA芯片技术可以在病理组织与正常组织之间一次比较成千上万个基因的表达变化，找出病理组织中表达异常的基因。Heller等提取正常及诱发病变的巨噬细胞、软骨细胞系、原代软骨细胞和滑膜细胞的 mRNA，用包含细胞因子、趋化因子、DNA结合蛋白及基质降解金属蛋白酶等几大类基因的cDNA芯片进行筛选，发现了数种变化明显的基因。其中除了有已知与类风湿关节炎有关的TNF，IL－1，IL－6，IL－ 8，G－CSF，RANTES，VCAM的基因外，还有编码基质金属弹性蛋白酶HME，IL-3，ICE，趋化因子Groα 等的基因。而以前认为金属弹性蛋白酶只存在于肺泡巨噬细胞和胎盘细胞中。弹性蛋白酶可以破坏胶原纤维及组织基底膜层，它在类风湿关节炎病理组织中的出现，为治疗该病提供了新的药物靶点。

　　利用DNA芯片来寻找疾病相关基因的策略尤其适用于病因复杂的情况。例如，恶性肿瘤的发生常常是多基因共同作用的结果，DNA芯片技术在肿瘤细胞基因表达模式及肿瘤相关基因发掘中具有重要的作用。Wang等将一些看家基因、细胞因子及受体基因、细胞分裂相关基因及其他一些癌基因共5766个基因的cDNA探针固定在芯片上，对正常卵巢组织及卵巢癌组织的mRNA进行分析，发现二者之间30％基因表达相差2倍以上，9％相差3倍以上，其中上调较为明显的有CD9．上皮糖蛋白（ep ithelial glycoprotein）、p27及HE蛋白激酶抑制物等。这些结果不仅进一步证实了以前用其他方法获得的结果，还提供了一些新的信息。再如，Kapp 等用包含950个DNA探针的DNA芯片分析比较霍奇金病细胞系L428及KMH2与EB病毒永生化的B淋巴细胞系LGL－GK的基因表达港，发现霍奇金病源的细胞系中白细胞介素-13（IL－13）及白细胞介素-5（IL－5）表达异常增高；用IL－13抗体处理霍奇金病源的细胞系可显著抑制其增殖。此发现提示，IL-13可能以自分泌形式促进霍奇金病相关细胞增殖。IL-13及其信号转导途径可能成为霍奇金病治疗及药

　　物筛选的新靶点。

　　建立模式生物细胞中的基因表达模型

　　采用模式生物细胞进行试验，条件容易控制，对模式生物基因表达的研究将启发人们发现和确认新的药物作用靶点。目前，已有多种模式生物（如酵母）的基因组计划已经完成。酿酒酵母（saccharomvces cerevisi ae）就是一种可用来进行药物筛选的较为理想的模式生物。它是真核生物而且基因组已全部测序，细胞繁殖快，易于培养，与哺乳动物细胞有许多共同的生化机制。现在已经发现，在酵母细胞中存在许多与人类疾病相关的基因。如人类Werner's综合征表现出早熟的特征，其细胞的生活周期变短。人类与此疾病相关的基因与酵母中编码DNA解旋酶的 SGS1基因极为相似。Botstein等得到了SGS1基因突变的酵母菌株，此突变菌株生活周期变短，细胞的表型特征与患有Werner's综合征入细胞相似。已有一些研究小组根据公布的酵母基因组序列，用PCR方法扩增了酵母6000多个开放阅读框（open reading frame，ORF）片段，制成DNA芯片，在整个基因组的范围内对酵母的基因表达进行检测。

　　建立病原作基因的表达模型

　　由于病原体的基因组规模相对较小，可用包含其全部基因的DNA 芯片鉴定那些对人产生毒害作用的基因。异烟肼（isoniazid，INH）是治疗肺结核的常用药物，其治疗结核病的机制是它阻断了分枝茵酸的生物合成途径。Wilson等根据已测序的肺结核杆菌基因组序列，用PCR方法扩增了3834个ORF（占全部 ORF的97％），固化在玻片上，制成检测肺结核杆菌基因表达的DNA芯片。用INH处理敏感菌株，发现除了生化途径已清楚的与分枝菌酸合成相关的一些基因转录水平发生变化外，还发现EfpA基因的表达也被诱导发生了变化，推测EfpA基因也参与了分枝菌酸的生物合成，而EfpA基因只在分枝菌属中一些致病的种类中才存在，故EfpA基因可以作为治疗结核病的新靶点。另外，分别用INH和 Ethionamide处理敏感菌株，获得了相似的基因表达谱，证实了两者具有相同的作用机制。

　　研究药物处理细胞后基因未达变化

　　药物与细胞（特别是敏感细胞）相互作用，将引起细胞外部形态及内部正常代谢过程的一系列变化。其内部生理活动的变化可集中表现在其基因表达的变化上。通过测定分析药物对细胞的基因表达的影响，可推测药物的作用机制，评价药物活性及毒性，进而确证药物靶点或者发现新的药物靶点。通过DNA芯片测定药物诱导的细胞基因表达变化来进行药物筛选与研究，对那些用常规方法很难追踪监测的药物或需要很长时间才能得到药物临床实验结果时，显得尤为有用。
通过监测阳性药物处理前后组织细胞基因表达变化情况可以获得许多十分有价值的信息。首先，经药物处理后表达明显改变的基因往往与发病过程及药物作用途径密切相关，很可能是药物作用的靶点或继发事件，可作为进一步药物筛选的靶点或对已有的靶点进行验证；其次，药物处理后基因表达的改变对药物作用机制研究有一定的提示作用。

　　

理论上讲，药物作用诱导的细胞基因表达变化应与缺失编码该药物作用靶点的基因引起的基因表达变化相似。Marton等使用含有6065个酿酒酵母的ORF的DNA芯片检测发现，由免疫抑制剂 FK506诱导的的基因表达变化在缺失编码被 FK506抑制的蛋白的基因变种中未观察到，但在缺失与FK506作用无关的基因变种中却视察到了。于是推测FK506除了与亲免蛋白（immunophilins）结合外还有其他被忽略的作用靶（off－target）。在实验基础上，他们提出了所谓的解码器战略（decoder strategy），即首先比较经过药物作用的野生株和缺失某些基因的变种株的基因表达谱，若二者相似，则将这种变种挑选出来，并将其与药物作用。如果突变基因所编码的蛋白质参与的生物途径受药物的影响，则药物诱导该变种的基因表达变化与药物诱导野生株基因表达变化将不同。用这种策略不仅可以确证药物作用靶，还可以发现未曾引起人们注意的作用靶，并可从这些被忽略掉的靶中推测药物的毒副作用。Cyclin依赖型激酶（cyclin－dependent kinas es，CDKs）在细胞增殖中有着重要的作用，是一种抗肿瘤药物的靶点。Gray等从2，6，9，-三取代嘌呤化合物库中筛选CDKs的抑制剂。他们将体外有活性的2种化合物flavopiridol和52（化合物代号）与酵母作用，然后用共含有260000个长度为25个碱基的一组寡聚核苷酸芯片检测酵母基因表达变化。试验结果表明，几乎所有的已知与细胞周期相关的基因表达下调。虽然flavopiridol和52体外活性相似，但他们引起的酵母基因表达的变化却有显著的差异，表明二者对酵母的作用途径是不一样的。

鬼臼亚乙苷（etoposide）是p53活化拓扑异构酶 Ⅱ的抑制剂，在临床上作为一种抗肿瘤药物。Wang 等经用鬼臼亚已苷作用人成骨肉瘤细胞系U2－ OS后，根据不同的时间间隔分别提取细胞mRNA，用寡核苷酸芯片测定6591条mRNA表达百的变化，发现62条mRNA表达县有变化。通过选取其中12条基因做进一步研究，发现有2条是已知的 p53调控基因（WAF1／p21和PCNA），有两条是新的p53靶基因，其余的与p53无关。在实验基础上，他们提出了介导鬼臼亚乙苷诱导细胞凋亡的信号传导途径。此项研究工作使人们又多获得一种抗肿痛药物的靶点。

　　应用DNA芯片还可直接筛选特定的基因文库以寻找药物的作用靶点。如给酵母某一特定的呈单倍体状态的基因对应的位置上放置一个遗传标记，该标记可被DNA芯片所识别，那么通过比较药物作用前后用芯片检测整个文库的结果，便有可能获得药物作用的靶基因。研究者称此种筛选方式为 haploinsufficiency drug screen。

　　用DNA微阵列芯片进行药物研究还存在如下一些缺点：①由于杂交样品制备复杂，采用DNA微阵列芯片很难实现高通量。②DNA微阵列芯片只能用于检测已知序列的基因。③由于灵敏度的限制，采用现存的DNA微阵列芯片难以检测到表达水平很低的基因。

　　除了DNA芯片外，组织芯片、蛋白质芯片和细胞芯片也在药物研究中崭露头角。最近，耶鲁大学的研究小组首次报道了真核生物蛋白质组水平的蛋白质微阵列芯片。他们表达和纯化了酵母的 5800种蛋白质，并将这些蛋白质点样固定在载玻片上，制作了酵母蛋白质组微阵列芯片。他们使用这种芯片筛选能与特定蛋白质和磷脂相互作用蛋白质，发现了新的能与钙调蛋白和磷脂相互作用的蛋白质。这种蛋白质微阵列芯片可以用于筛选与蛋白质相互作用的药物，还可以用于检测蛋白质翻译后的修饰。他们的研究成果证实了制作和使用蛋白质组微阵列芯片进行功能分析检测的可行性，并向人们预示了蛋白质微阵列芯片在药物开发领域的广阔应用前景。

　　Zlauddin和Sabatinl发明了一种细胞微阵列芯片。他们首先将不同的质粒DNA点在玻璃片上，做成质粒DNA做阵列芯片。接着用脂质转染试剂处理该质粒DNA微阵列芯片，然后在处理好的质粒DNA微阵列上培养哺乳动物细胞。点在芯片上的质粒DNA在转染试剂的帮助下原位转染哺乳动物细胞，在质粒DNA微阵列的每一个质粒样品点的相同位置形成了转染了该质粒的细胞群。细胞因获得了外源DNA而获得了新的性状。这样，由质粒DNA芯片制成了由不同性状细胞组成的细胞做阵列芯片。他们尝试用这种细胞芯片来确证药物作用靶点，寻找能改变细胞生理状态的基因产物。这种新型细胞芯片可以用来在哺乳动物细胞内高通量筛选有可能成为候选先导分子的化合物、蛋白质或寡核苷酸。在功能基因组研究和药物开发等领域具有很大的应用潜力。

　　2 生物芯片作为超高通量筛选平台的应用

　　在过去的十几年里，随着科学的进步以及在巨大的经济利益驱使下，药物筛选技术得到了飞速的发展。在80年代中期（高通量筛选形成之初），每天只能筛选30种化合物，到90年代中期，每天可筛选1，500种化合物，而如今每天可筛选超过 100，000个化合物。高速、低成本的高通量筛选已成为当今药物筛选的主流，并逐渐向超高通量方向发展。在过去的几年中，世界上著名的制药公司纷纷与以高通量药物筛选技术为核心的中小型生物科技公司结盟或合作，采用高通量或超高通量药物筛选技术进行先导物分子的筛选。要进一步提高筛选率，高通量筛选技术的各个方面均需要技术创新，这为生物芯片技术进入药物筛选领域提供了宝贵的契机。

　　提高药物筛选的通量，实现超高通量筛选有2 条途径：一是微型化，一是自动化。生物芯片作为一种新型技术平台，正可满足超高通量筛选微型化和自动化的需要。生物芯片技术应用于超高通量筛选有2个发展方向：一是微孔板/微阵列技术，一是微流体芯片技术。

　　微孔板/微陈列技术

　　微孔板技术的发展主要表现在板孔数的增加。目前，使用最多的是96孔及384孔板，也有人使用1536孔、3456孔、甚至 9600孔板。如Oldenburg等报道了用9600孔板（0.2μL/孔）分析系统，以金属蛋白酶为靶，对组合及分离纯化的化合物库进行筛选的结果。虽然随着材料科学和加工技术的发展，微孔板技术有了长足的进步，但其发展面临着一些不易解决的困难，主要有：微量液体极易蒸发，不适于那些不能用二甲亚砜（DMSO）作溶剂的筛选方法以及受限于当今还不够完善的微量液体分配技术。

　　微阵列技术是将微孔板技术进一步微型化。最近，哈佛大学的研究人员开发了化合物微阵列芯片，主要用于筛选能与特定蛋白质特异性结合的化合物。他们将玻片表面进行化学处理，使其衍生化产生活性基团，然后将溶于有机溶剂中的化合物用机械手点在经处理的玻片表面，化合物与玻片表面的活性基团反应而被固定于玻片表面，这样就将不同的化合物排布成微阵列，固定在玻片表面，制成化合物微阵列芯片。随后将感兴趣的蛋白质进行荧光标记，然后与微阵列芯片上的化合物反应，经清洗后，再进行荧光检测就可以筛到能与这种蛋白质特异性结合的化合物。他们用化合物微阵列芯片进行了原理性实验，其结果表明，使用这种化合物微阵列芯片可以并行、快速地进行大规模的化合物与蛋白质的结合筛选。他们最先是将玻璃片表面进行马来酰亚胺衍生化处理，后来采用亚硫酰氯处理，都获得了成功。他们还尝试了使用这种化合物微阵列芯片进行大规模对映异构体的分型检测。加利福尼亚大学Davis分校的科学家们采用类似的方法也制造了一种化合物微阵列芯片。他们对玻琥载玻片表面进行氨基化处理，在氨基玻片上进行乙醛酰衍生化，然后将带有连接臂的配体分子点在修饰过的玻片表面。在进行化学连接反应之后，这种固定了不同小分子配体的微阵列芯片被用来进行了3种生物学检测：蛋白质结合检测、功能磷酸化检测和活细胞粘附检测。实验结果证实了化合物微阵列芯片可以帮助我们对由组合合成方法获得的大量化合物进行快速的功能分析和筛选。化合物微阵列芯片技术与基于微珠体的固相组合会成技术相结合为高通量药物筛选带来了一条新的途径，将对高通量药物筛选技术的发展产生积极的影响。

谢谢，比较详细